首页分享蔷薇属栽培品种的繁殖和体外开花的制作方法

蔷薇属栽培品种的繁殖和体外开花的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-10-15 21:52

专利名称：蔷薇属栽培品种的繁殖和体外开花的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物栽培、植物无性繁殖及园艺学领域。本发明特别涉及蔷薇属(rose)植物或组织培养物的无性繁殖，以及体外诱导来源于蔷薇属植物或者组织培养物的蔷薇属幼株开花。更具体地说，本发明涉及用于蔷薇及蔷薇属植物的体外微繁殖(micropropagation)、花芽诱导以及开花的培养基配方和有效的方法。
背景技术：
蔷薇属属于蔷薇科(Rosaceae Juss)。该科非常大，其成员包括100余个属和2000个草本及木本的种。很多重要的食用植物和观赏植物都属于蔷薇科，例如草莓、苹果、杏、樱桃、梨及黑梅。蔷薇属发展至今，其准确的物种数目尚不清楚。大多数的蔷薇属植物生长于北半球温带，主要是在中国南部及远东，到喜马拉雅山脉和孟加拉直至埃塞俄比亚，西至北美洲，从北极圈地区到新墨西哥州。周期性开花或终年开花的蔷薇属在18世纪末从远东传入欧洲，其来自于中国、印度、日本无数次传代培养。蔷薇属是全世界最流行的花之一。蔷薇属一般被做成切花(cut flower)、盆栽植物、或者家庭花园中的栽培植物。切花又分为很多种，包括例如长茎、短茎、小花甜心以及多花束扎蔷薇属。
由于目前大多数的商用蔷薇属品种都是杂交的，选择从种子开始的繁殖过程就不十分合适，主要是因为这样子代间会出现性状分离问题。杂交切花蔷薇属的商业化繁殖一般都是通过出芽或者将特定的嫩枝插条或者芽移植嫁接到野生蔷薇属的根茎上进行的。而对于小号的瓶装蔷薇属，一般的惯例是在温室里经插条进行田间无性繁殖。可以替代上述方法的一种方法就是微繁殖，也被称为腋芽繁殖或者体外无性繁殖，即是在消毒无菌条件下进行腋芽繁殖。微繁殖的优点在于快速对所需植物品种进行繁殖，并可得到相同遗传基因的植物幼苗。从微繁殖得到的幼苗还是无菌的，没有细菌、真菌和病毒的污染，也没有病虫害。微繁殖的过程包括从相近种属的植物中选择准备外植体(explant)，在含有植物生长激素的培养基上进行外植体的培养，孵育，纯种幼芽(或者带根幼芽)的再生(详见Douglas分子生物学方法，Vo1.6，W.Pollard，J.M.、Walker，编辑.(1990)；George和Sherrington，Exegetics，Ltd.U.K.，p.3(1984)；和Brown和Thorpe细胞培养和植物体细胞遗传学，p49-65，I.K.Vasil编辑.(1986))。微繁殖为所需植物的大量繁殖提供了一种可能的经济有效的方法。本技术的一个重要出发点在于能够增加所繁殖的植物品种的经济价值。查阅相关的文献，我们发现目前的繁殖方案在诱导植物幼苗体外开花上大多非常低效。其效率主要取决于所用的栽培品种，但是即使是最好的品种效率也很低(大约10％)。
最近几年，长度从7.5cm到20cm不等的盆栽蔷薇属品种变得非常走俏，这是因为与切花相比，他们的包装比较紧密而且花期更长。而且，在合理的价格下可以同时开多个花的能力，使得盆栽的蔷薇属得到更大的普及。同时，全世界也推出了微型蔷薇属杂交品种的培养方法。例如，仅在美国就已经有超过300个微型蔷薇属杂交品种登记在册。最著名的商业微型蔷薇属杂交育种公司是丹麦的Poulsen Roser ApS(注册商标是PARADE)和新西兰的De Ruiter的New Rose国际公司。微型盆栽蔷薇属可以种植在花园里，院子里，甚至可以放在房间里以起到装饰效果。但是，微型盆栽蔷薇属作为室内装饰尚有一定限制，这主要是因为瓶内需要泥土。而且，考虑到平均15-30cm的总高度(包括花瓶)，即使是盆栽蔷薇属放在例如桌子这样的地方上也仍旧是太高了些。还有，由于全世界变得越来越城市化，越来越多的人有更多的时间是在室内活动的，比如说家里或者是办公室。于是，就出现了一种对多花、花期长、清洁而且紧凑的装饰性蔷薇属的需求。
蔷薇属的商业化繁殖一般通过出芽或者将特定的嫩枝移植嫁接到野生蔷薇属的根茎上进行的。最近几年里，很多文献都涉及到通过组织培养物进行蔷薇属繁殖的问题。查阅文献发现所提到的不同的变种和型在营养物和激素需要两个方面大不相同。大多数的商业蔷薇属培育者仍然使用传统方法进行蔷薇属的繁殖。用于爬墙蔷薇属的培养基Improved Blaze使得三种微型蔷薇属品种有明显的生长，但却不是对所有的杂交茶蔷薇属有效(Hasegawa，J.Amer Soc.Hort.Sci.1980，105216-220)。而且，与另外两个老牌的世界品种大马士革蔷薇(R.damascena)和犬蔷薇(R.canina)相比，繁殖杂交品种Tropicana和Bridal Pink时所需的植物生长调控因素有相当大的不同(Khosh-Khui和Sink，J.Hort.Sci.198257，315-319；Khosh-Khui和Sink，Scientia Horticultulrae 1982 17，371-376)。
为了优化生长条件，大多数研究都集中在改变特定的生长调控因子的浓度上(Hasegawa，见上)，还有一些研究观察了其它因素的影响，这些因素包括某些有机或者无机成分、芽的位置、温度、每日光照时间、Murashige和Skoog两个成分的浓度以及移栽之间的培养周数(Khosh-Khui和Sink，上述Bressan等，J.Amer.Soc.Hort.Sci.1982107，979-990)。授予Dobres等的美国专利5,843,782公开了一个蔷薇属微繁殖的方法，其包含在第一个培养基上培养带有节点的茎干，所述培养基中包含细胞分裂素、植物生长素和赤霉素，在第二个培养基上生产可以移栽到土中的开花蔷薇属，所述培养基中包含细胞分裂素、植物生长素和赤霉素。
本发明主要涉及开发用于繁殖微型蔷薇属幼株以及有效地体外培养诱导开花以在无需盆栽及无土的情况下生产微型蔷薇属的新的组合物和方法。在一个优选的实施方案中，利用本发明可以让蔷薇属在一个封闭的内部装有培养基的容器内开花，以用于商贸和装饰。
这里将所列举的用来说明本发明的背景或为具体实施提供细节的文献和其它材料作为参考文献并入本说明书。

发明内容
一方面，本发明提供了用于蔷薇属或者蔷薇属组织培养物的无性繁殖和繁殖的方法。
另一方面，本发明提供了体外诱导经繁殖后的植物幼株开花的方法，所述植物幼株是蔷薇属或者蔷薇属组织培养物经繁殖后得到的。
另一方面，本发明提供了用于对源于蔷薇属或者蔷薇属组织培养物的繁殖后幼株进行微繁殖及体外开花的组合物。
在一个实施方案中，盆栽蔷薇属的幼枝培养在第一培养基上，所述培养基包含无机营养物，维生素，细胞分裂素，植物生长素，作为碳源的蔗糖，这样直到幼枝上萌出芽。将芽从幼枝上切下，移入装有第一培养基的密闭容器中，培养约50天，它会出幼苗和新的芽。将这些新形成的芽切下，移入装有第一培养基的密闭容器中，培养，直到更多的幼苗和芽长出来。在繁殖步骤之后，切下蔷薇属的芽，继续在第一培养基上培养，以获得更多的幼苗。
在一个优选的实施方案中，将幼苗移入第二培养基上诱导花芽，所述培养基中包含无机营养物，维生素，作为碳源的蔗糖，植物激素苯基噻二唑脲(thidiazuron)，细胞分裂激动素，植物生长素以及任选加入的肌醇。在这个方案中，幼苗的花芽诱导成功后，移入伸长(elongation)培养基上，后者包含无机营养物，维生素，碳源蔗糖，细胞分裂素，植物生长素和肌醇。伸长后，将植物幼苗放入含有无机营养物、维生素及赤霉素的培养基上培养，使之体外开花。
在另一个实施方案中，一旦繁殖出芽，幼苗就被移入含有无机营养物、维生素、碳源蔗糖、细胞分裂素玉米素、肌醇的培养培养基上诱导花芽。接下来，在本方案中，幼苗就直接被移入包含有无机营养物、维生素及赤霉素的培养基上，使之体外开花。
附图简述本专利申请文件包括至少一幅彩图。如有需要，将由美国专利商标局提供本专利的彩色复印件，但需付必要的费用。

图1为一流程图，示出完成包括繁殖和可栽培微型蔷薇属体外开花等各步骤在内所需的时间。图2示出在密闭容器内体外蔷薇属幼株开花的整体图。图3示出放置在架上的装有开花蔷薇属幼株的多个密闭容器的整体图。
发明详述一方面，本发明提供了用于蔷薇属或者蔷薇属组织培养物的无性繁殖和繁殖的方法。
另一方面，本发明提供了体外诱导植物幼株开花的方法，所述植物幼株是蔷薇属或者蔷薇属组织培养物经繁殖后得到的。
另一方面，本发明提供了用于对源于蔷薇属或者蔷薇属组织培养物的繁殖后幼株进行微繁殖及体外开花的组合物。
在一个实施方案中，盆栽蔷薇属的幼枝培养在第一培养基上，所述培养基包含无机营养物，维生素细胞分裂素，植物生长素，作为碳源的蔗糖，这样直到幼枝上萌出芽。将芽从幼枝上切下，移入装有第一培养基的密闭容器中，培养约50天，它会出幼苗和新的芽。将这些新形成的芽切下，移入装有第一培养基的密闭容器中，培养，直到更多的幼苗和芽长出来。在繁殖步骤之后，切下蔷薇属的芽，继续在第一培养基上培养，以获得更多的幼苗。
我们发现，与过去的已知方法相比，增加诱导花芽这一步骤，其中向培养基中加入植物激素，这一步骤大大的提高了蔷薇属栽培品种的开花效率。我们还观察到提高体外开花的效率不需要在最后的培养基中加入植物激素。最后一点，我们发现与现有技术相比，在特殊的例子中，在诱导花芽之后和培养体外开花之前加入伸长步骤(该伸长培养基中还包含其它植物激素成分)，也可以提高体外开花的效率。在一个优选的实施方案中，幼苗在含有细胞分裂素、植物生长素及碳源蔗糖的第一培养基上繁殖后，将幼苗移入第二培养基上诱导花芽。该培养基中包含无机营养物，维生素，作为碳源的蔗糖，植物激素苯基噻二唑脲，细胞分裂激动素，植物生长素以及肌醇。在这个方案中，幼苗的花芽诱导成功后，将之移入伸长培养基上，后者包含无机营养物，维生素，碳源蔗糖，细胞分裂素，植物生长素和肌醇。伸长后，将植物幼苗放入含有无机营养物、维生素及植物生长素的培养基上伸长，然后，将伸长后的植物幼株移入含有无机培养物、维生素及氨苄西林的培养基上培养，使之体外开花。
在另一个实施例中，一旦在第一培养基上繁殖出芽，幼苗就被移入含有无机营养物、维生素、碳源蔗糖、细胞分裂素玉米素、肌醇的培养基上诱导花芽。接下来，幼苗就直接被移入包含有无机营养物、维生素及氨苄西林的培养基上，使之体外开花。
在所有这些例子中，源于植物繁殖的蔷薇属植株可以是正在开花的蔷薇属，可以在本发明的培养基上保存和展示。未开花的植物幼株则可以用于另一个繁殖步骤中。
组织培养蔷薇属植株微繁殖用的培养基也是本发明的一个实施方案，所述培养基包含约1.0-2.0mg/L苄基腺嘌呤，约0.05-0.1mg/L吲哚乙酸或者萘乙酸，约1.5％-2.0％的蔗糖作为碳源。所述培养基优选地含有约2.0mg/L苄基腺嘌呤，0.1mg/L植物生长素，2.0％蔗糖。本发明的培养基中不包含赤霉素。
包括开花蔷薇属在内，经此方法生产的蔷薇属植株也属本发明的范畴。蔷薇属植物，优选为蔷薇属，最优选是从Orange(桔红)PARADE，Fiesta(假日)PARADE，Scarlet(鲜红)PARADE，Bianca(比安卡)PARADE及Frosty(霜白)PARADE中选择培育出来的品种。
本发明还涉及到蔷薇属组织培养物，其包含在密闭的容器中培养长有节点的蔷薇属茎干，所述容器中含有本发明的培养基。所述蔷薇属茎干至少应包含一个枝桠，可以大量生产例如开花蔷薇属的蔷薇属组织培养物。蔷薇属外植体也属于本发明的范围。蔷薇属外植体可以选自长有节点的蔷薇属茎干、长有节点和至少一个幼枝的蔷薇属茎干以及蔷薇属幼枝。将蔷薇属外植体放在盛有培养基的密闭容器内培养，直至其长出蔷薇属植株，例如开花蔷薇属。
另外，本发明还涉及下述问题，即开花蔷薇属植株可以在一段时间内保存在培养基上，且无需添加肥料或水分即可存活。一般说来，蔷薇属在密闭容器内的花期可达一个月。本发明的唯一限制是，密闭容器必须是可以保存住含有水及矿物质、盐及维生素等营养物的固体培养基，而不会发生渗漏。在特殊的实施方案中，培养基也可以包含一种或者多种染料，这样就可以选择性的提高器皿内的体外培养的开花植株的魅力和吸引力。在一个实施方案中，密闭容器由一个底座和一个盖子组成，这两部分是粘连在一起的，这样在手持或者运输过程中就不会分开，也可以保持其内部的湿度。其盖子，最好是整个容器，都是由高透明度，高清晰度的材料制成的，容器内壁应覆有一层能够防止水分在其内表面凝结的化学物质，这样就可以清楚地看到其内的体外开花的幼株。聚碳酸酯、多聚甲基丙烯酸甲酯和玻璃都是合适的材料。其它任何可以耐受高热(如＞160℃)和高压(≥2个大气压)同时又有高清晰度的材料也都可以使用。例如，这样的防凝雾化学物质包含Sicanett，意大利Anfora(SV)产品和Siclair(Nettoyant universal)，由法国SI-International S.A.生产。将这种防凝雾的物质直接喷在容器的内壁上。本发明还涉及到前面提及的组织培养微繁殖方法两步中的每个独立步骤。在这个大体框架内，除了前述的成分苄基腺嘌呤和吲哚乙酸或者萘乙酸，本发明的培养基中还可能包含有其它营养成分。优选的培养基是改良的Murashige和Skoog(MS)基本培养基(在Murashige等，Physiol.Plant.，Vol.15，pp.473-97(1962)中有述)。改良的MS培养基是含有Gamborg维生素B5(最终浓度为10mg/L的盐酸硫胺素，1mg/L的尼克酸，1mg/L的维生素B6及100mg/L的肌醇)的MS培养基，pH5.8，含2％蔗糖，用0.30％植物胶制成凝胶状。在优选的实施方案中，所述培养基中可以含有不同的植物激素以及这里提及的其它附加物。
在本发明特定的实施方案中，植物生长素包含吲哚乙酸和萘乙酸。细胞分裂素包含苯基噻二唑脲、苄基腺嘌呤激动素和玉米素。
苄基腺嘌呤可以用其它的天然或者人工合成的细胞分裂素替代，后者选自6-苄基氨基嘌呤核糖核苷、6-(y-y-双甲基烯丙基氨酸)嘌呤、DL-双氢玉米素、t-玉米素核糖核苷、玉米素、N-(2-氯-4-吡啶)-N′-苯脲、N-苄基1-9(2-四氢吡喃)腺嘌呤、激动素、激动素核糖核苷及其类似物，其中细胞分裂素可以一种单独使用或者几种同时使用。吲哚乙酸可以用其它的天然或者人工合成的植物生长素替代，后者选自萘乙酸、吲哚丁酸、毒莠定、麦草畏及其它类似物，一般浓度都在约0.03-0.3mg/l左右。植物生长素可以一种单独使用或者几种同时使用。针对各种不同的植物，培养基可以改良使用不同的激素要素组成。诱导开花时，可以在基本培养基中改变营养水平。比如说，MS培养基提供的成分，是供组织培养的植物细胞营养和生长的基本必要成分，可以由其它的本技术领域来说很普通的培养或者生长培养基替代。本领域技术人员应了解针对不同的蔷薇属品种选择不同组成配比的培养基。一般说来，最初各成分的浓度都低一些，然后根据需要达到的效果增加剂量。
诱导开花时，混合物中苯基噻二唑脲的浓度最好是在0.4-0.5mg/L之间。
玉米素的浓度最好是在0.5-1.0mg/L之间。
在繁殖和生长步骤中，培养基中苄基腺嘌呤的最佳浓度是约2mg/L。在已诱导出花芽的幼株的伸长步骤中，培养基中苄基腺嘌呤的最佳浓度是约0.1mg/L。
在本发明中，培养基中萘乙酸作为植物生长素的浓度不得超过2mg/L。其最佳浓度在0.05-0.1mg/L之间。
在本发明中，培养基中吲哚乙酸作为植物生长素的浓度一般在0.05-0.1mg/L之间。繁殖幼株时其最佳浓度是0.1mg/L。在已诱导出花芽的幼株的伸长步骤中，培养基中苄基腺嘌呤的最佳浓度是约0.1mg/L。
对于本领域人员来说显然会对微繁殖条件进行各种不同的改变，同时还包括选择用于初始培养的供体组织，后者来自于具有合适的基因型、生理状态以及生长状态的植株。另外，不同来源的外植体、植物的品种以及培养品种所处的自然环境都属于本发明所预期的范围。例如，就改善密闭容器中的蔷薇属品种来说，气体环境、温度和光照条件可能都需要有所不同。一般说来，诱导花芽的最佳温度应≤25℃。任何合适的胶凝剂都可以使用，例如但不限于包含PHYTAGELTM的凝胶，包含GEL RITETM的凝胶；包含AGARGELTM的凝胶；琼脂也可以，例如但不限于A，E，和M型琼脂、纯化High Gel Strength、Bacteriological Flake；AGARGELTM琼脂混合物以及PHYTAGELTM；还有琼脂糖，例如VII型、褐藻酸、角叉胶、转移胶及羟乙基纤维素等。
蔷薇属外植体是本发明的一个实施方案。所述蔷薇属外植体可以在包含上述培养基的密闭容器中培养，直至生产出蔷薇属植株，如开花蔷薇属。外植体可以来自于植株，例如但不限于蔷薇属，包括但不限于蔷薇属(genus Rosa)，例如但不限于以下栽培品种桔红PARADE，假日PARADE，鲜红PARADE，比安卡PARADE、霜白PARADE等；大马士革蔷薇，野蔷薇，法国蔷薇等。本发明的组织培养技术包含在密闭容器中培养蔷薇属外植体，所述容器可以使用如培养皿、试管、烧瓶、eppendorf管、儿童食品瓶、罐头瓶、或者任何能够根据本发明的方法支持本发明的蔷薇属生长的密闭的容器。
包括开花蔷薇属在内，利用本发明的方法培养出的蔷薇属也属于本发明的范畴。蔷薇属植株可以保存在密闭容器中。蔷薇属组织培养物或其幼株也属于本发明的范畴。蔷薇属组织培养物可以生产蔷薇属，例如开花蔷薇属。
密闭容器内的蔷薇属可以用于筛选花色及花形的新培育品种。例如，可在蔷薇属愈伤组织、外植体或者腋芽的组织培养过程中对植株进行突变处理。可将突变后的蔷薇属植株放置在本发明提供的培养基上生长，然后对花色、花形、抗病能力、生长活力、冷热度敏感性及其他有价值的特性进行筛选。另外，本发明还可以实现培养中的蔷薇属植株的异花传粉。例如，由于蔷薇属的花显然包含雌雄两种成熟的性器官，于是这样的花的传粉过程既可以是接受了来自同一朵花的花粉又可以是接受了来自另一朵花的花粉。或者，花可以在体外繁殖并保存或者展示在用于装饰的透明干净的容器内。方法概要本说明书使用了下述术语。
苄基腺嘌呤是一种细胞分裂素类的植物激素。
玉米素是一种细胞分裂素类的植物激素。
萘乙酸或者2-萘乙酸是一种植物生长素类的植物激素。
吲哚乙酸或者3-吲哚乙酸是一种植物激素。
细胞分裂素一词是指一种植物激素。在低浓度下，这些有机物可以促进根细胞的伸长。
植物生长素一词是指一种植物激素。在低浓度下，这些有机物可以促进植物芽的伸长并控制其它特殊生长作用。植物生长素包括吲哚丙酸(IPA)、脱落酸(ABA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，萘乙酸及GA3。
“栽培品种”一词是指有商业价值的、源于园艺培育的变种，与自然生长产生的变种不同。
这里所谓的“微繁殖”是指植物的体外无性克隆繁殖，其中在含有适当浓度的植物激素、矿物质、维生素及碳源等培养基上培养母代植物，经诱导得到芽，进而得到大量的新幼枝，这一切都可以在很短的时间内实现。
以下为在本发明的实际应用中所用的培养基RMS0改良MS培养基，包括全效的Murashige Skoog无机营养物及Gamborg维生素B5(维生素的最终浓度为10mg/L，烟酸1mg/L，维生素B61mg/L，肌醇100mg/L)，pH5.8，2％蔗糖，以0.30％植物胶使之凝结。在不同的发育阶段，培养基中的植物激素有所不同。
RMS1RMS0加入2mg/L6-苄基腺嘌呤及0.05mg/L萘乙酸。
RMS2RMS0，其中蔗糖浓度为3％，加入0.4-0.5mg/L苯基噻二唑脲、0.05mg/L萘乙酸、0.1mg/L激动素及400mg/L纤维醇。
RMS3RMS0，其中蔗糖浓度为3％，加入0.5-1.0mg/L玉米素，0.05mg/L萘乙酸及400mg/L纤维醇。
RMS4RMS0，其中蔗糖浓度为3％，加入0.1mg/L苄基腺嘌呤、1.0mg/L吲哚乙酸及400mg/L肌醇。
RMS5RMS0，其中蔗糖浓度为2％，加入2mg/L苄基腺嘌呤及0.1mg/L吲哚乙酸。通过母体出芽的方式获得外植体在优选的实施方案中，有腋芽的幼小枝条被用作外植体。为了确保在培养基上的外植体没有细菌及真菌感染(污染物)，在使用前对外植体的表面要进行消毒。许多本领域的消毒技术都可以用于培养用外植体的准备。这些技术包括将外植体浸入到含有至少一种消毒物质的溶液中。这样的消毒物质包括次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞及普通酒精等。
在本发明的优选的方法中，将来自成熟植株的10-12cm长的幼枝剥掉外面的叶子，然后在流动的水下清洗，0.1％HgCl2消毒5-10分钟，再用流动的水彻底冲洗不少于30分钟。幼枝浸没在10-15％的CloroxR(含有5.25％次氯酸盐)溶液内10-15分钟。最后用蒸馏水冲洗幼枝4-6次。幼枝可以来自于利用本领域熟知的技术得到的蔷薇属植株组织培养物。因此，我们预期来自于组织培养物的幼枝可以替代来自成熟植株的幼枝，而并不脱离本发明的范围。形成幼苗将外植体放置在固态培养基上，在16小时光照条件下培养，光照强度为4500-5500lux(由日光灯提供光源)。如果幼苗接受上述光照条件照射，温度应保持在23℃。如果移去光源，幼苗的环境温度应保持在19度。整个幼枝在RMS培养基上培养，(RMS0内加入2mg/L6-苄基腺嘌呤及0.05mg/L萘乙酸)。外植体渐渐反青，并通常在15天有后幼芽形成。及时将幼芽切下，以备幼苗繁殖之用。增殖幼苗繁殖增殖，是指从幼年或者重新恢复幼稚的生长中植物的某个部位获得整个植物体的过程。这个部位一般是生长点或者是在根尖或芽尖的细胞快速分裂的区域，即所谓分生组织(meristemmaterial)。来自于芽的取材被放置在事先确定的激素和营养培养基上，以获得外植体，然后渐渐形成长有新芽的幼苗。将幼芽逐个从外植体移除，培养在与上述相同的事先确定的激素和营养培养基上，以从一个幼枝上获得多个幼苗。植物这样单一亲代的无性繁殖，保证了克隆所得到的植物后裔有与其亲代同样的基因特征。将切下的芽放入RMS1培养基上培养大约50天。依上述步骤培养，芽长成幼苗并且在这些幼苗上有新芽形成。可以切下时，将新形成的芽切下、移入新的RMS1培养基上，以备繁殖和幼苗的增殖。增殖比例一般是开始培养时外植体数目的4-7倍左右。诱导花芽诱导花芽对于达到商业规模的体外开花来说是非常重要的。本发明提供了两种不同的诱导花芽的方法以供选用。
在一个实施方案中，通过在装有RMS2培养基的密闭容器中培养增殖后的幼苗诱导花芽增殖。诱导培养大约需要50天。然后，将幼苗移入密闭容器中保存，容器中含有培养基RMS4用于伸长步骤，后者大约需15-30天。伸长步骤之后，幼苗被移入含有20mg/L-50mg/L氨苄西林的MS0上。通常10-20天内开花。
在一个可供选择但仍旧是优选的实施方案中，增殖后，通过在装有RMS3培养基的密闭容器内培养增殖幼苗以诱导花芽，大约需要50天。诱导后，将幼苗直接移入含有20mg/L-50mg/L氨苄西林的MS0上。通常15-20天内开花。
实施例本发明在下述实施例中将得到进一步详述。所提供的实施例均用以说明本发明，但不对本发明构成任何限制。实施例使用了本技术领域内标准的已知技术以及下述的特殊技术。
应当认识到，本发明的方法及组合物可组合成各种不同实施方案，这里公开的只是其中很小的一部分。对于本技术领域的专业人员来说，很明显存在着其他的实施方案且并不脱离本发明的主导思想。因此所述的实施方案只是例证性的不要解释为限制性的。
权利要求
1.用于蔷薇属植株的微繁殖及使所述植株的蔷薇开花的方法，其包含(a)从成熟蔷薇属植株或者蔷薇属的组织培养物中取材，在无菌的条件下制备幼枝；(b)在密闭容器中的第一培养基上培养幼枝，所述第一培养基包含细胞分裂素、植物生长素以及作为碳源的蔗糖以用于生产有芽的外植体；(c)将芽从外植体上移除；(d)在密闭容器中的第一培养基上进行芽的繁殖以产生具有新生芽的幼苗；(e)在密闭容器中的第一培养基上增殖所述幼苗；(f)在密闭容器中的第二培养基上培养所述经过增殖的幼苗以诱导花芽，所述的第二培养基至少包含一种细胞分裂素和一种植物生长素；(g)在密闭容器中的第三培养基上培养所述有花芽的幼苗，所述的第三培养基包含蔗糖作为碳源。
2.用于蔷薇属植株的微繁殖及使所述植株的蔷薇开花的方法，其包含(a)从成熟蔷薇属植株或者蔷薇属的组织培养物中取材，在无菌的条件下制备幼枝；(b)在密闭容器中的第一培养基上培养幼枝，所述的第一培养基包含苄基腺嘌呤、选自萘乙酸和吲哚乙酸的植物生长素以及作为碳源的蔗糖以用于生产有芽的外植体；(c)将芽从外植体上移除；(d)在密闭容器中的所述第一培养基上进行芽的繁殖，以产生具有新生芽的幼苗；(e)在密闭容器中的所述第一培养基上增殖所述幼苗；(f)在密闭容器中的第二培养基上培养所述经过增殖的幼苗以诱导花芽，所述的第二培养基包含苯基噻二唑脲、细胞激动素、作为碳源的蔗糖、肌醇和萘乙酸；(g)在密闭容器中的第三培养基上培养所述有花芽的幼苗，以诱导伸长及体外开花，所述的第三培养基含有作为碳源的蔗糖、苄基腺嘌呤、吲哚乙酸及肌醇；并(h)在密闭容器中的第四培养基上培养所述伸长了的幼苗，所述的第四培养基包含作为碳源的蔗糖和抗生素。
3.权利要求2的方法，其中所述第一培养基中苄基腺嘌呤的浓度在大约1.0mg/L到大约2.0mg/L之间，而蔗糖的浓度大约为2％。
4.权利要求3的方法，其中所述第一培养基中植物生长素萘乙酸的浓度在大约0.05mg/L到大约0.2mg/L之间。
5.权利要求3的方法，其中所述第一培养基中植物生长素吲哚乙酸的浓度应大约0.1mg/L。
6.权利要求2，3，4或5中任一项的方法，其中所述第二培养基中苯基噻二唑脲浓度在大约0.1m/L到大约0.3mg/L之间，激动素的浓度大约为0.1mg/L，肌醇的浓度在250mg/L到500mg/L之间，蔗糖的浓度在1.5％到3％之间。
7.权利要求6的方法，其中所述第二培养基中苯基噻二唑脲浓度在大约0.4mg/L到大约0.5mg/L之间，肌醇的浓度大约为400mg/L，蔗糖的浓度大约为3％。
8.权利要求6或者7的方法，其中所述第三培养基中苄基腺嘌呤的浓度在大约0.5mggg/L到0.2mg/L之间，吲哚乙酸的浓度大约为1mg/L，肌醇的浓度在250mg/L到500mg/L之间，蔗糖的浓度大约为3％。
9.权利要求8的方法，其中所述第四培养基中蔗糖的浓度大约为2％，抗生素氨苄西林的浓度在20mg/L到50mg/L之间。
10.用于蔷薇属植株的微繁殖及使所述植株的蔷薇开花的方法，其包含(a)从成熟蔷薇属植株或者蔷薇属的组织培养物中取材，在无菌的条件下制备幼枝；(b)在密闭容器中的第一培养基上培养所述幼枝，所述的第一培养基包含苄基腺嘌呤、选自萘乙酸和吲哚乙酸的植物生长素以及作为碳源的蔗糖以用于生产有芽的外植体；(c)将所述芽从外植体上移除；(d)在密闭容器中的所述第一培养基上进行芽的繁殖以产生具有新生芽的幼苗；(e)在密闭容器中的所述第一培养基上增殖所述幼苗；(f)在密闭容器中的第二培养基上培养所述经过增殖的幼苗以诱导花芽，所述的第二培养基包含玉米素、作为碳源的蔗糖、肌醇和萘乙酸；(g)在密闭容器中的第三培养基上培养所述具有花芽的幼苗以诱导伸长及体外开花，所述的第三培养基含有作为碳源的蔗糖和抗生素。
11.权利要求10的方法，其中所述第一培养基中苄基腺嘌呤的浓度在大约1.0mg/L到大约2.0mg/L之间。
12.权利要求11的方法，其中所述第一培养基中植物生长素萘乙酸的浓度在大约0.05mg/L到大约0.2mg/L之间。
13.权利要求11的方法，其中所述第一培养基中植物生长素吲哚乙酸的浓度为大约0.1mg/L。
14.权利要求10，11，12或13中任一项的方法，其中所述第二培养基中玉米素的浓度在大约0.5mg/L到大约1.0mg/L之间，激动素的浓度大约为0.1mg/L，肌醇的浓度在250mg/L到500mg/L之间，蔗糖的浓度在1.5％到3％之间。
15.权利要求14的方法，其中所述第二培养基中肌醇的浓度大约为400mg/L，蔗糖的浓度大约为3％。
16.权利要求15的方法，其中所述第三培养基中蔗糖的浓度大约为2％，抗生素氨苄西林的浓度在20mg/L到50mg/L之间。
17.权利要求1，2或10中任一项的方法，其中每种培养基还包含营养培养基。
18.权利要求17的方法，其中所述的营养培养基包含有MS培养基及Gamborg′sB5维生素。
19.权利要求1，2或10中任一项的方法，其中所述蔷薇属植株是蔷薇属杂交品种。
20.权利要求19的方法，蔷薇属杂交品种选自PARADE蔷薇属变种的栽培品种。
21.权利要求20的方法，其中所述蔷薇属杂交品种选自桔红PARADE，假日PARADE，鲜红PARADE，比安卡PARADE、霜白PARADE的栽培品种。
22.用于蔷薇属植株的组织培养物微繁殖的培养基，其包含大约1.0mg/L至2.0mg/l的苄基腺嘌呤，大约1.0mg/L至2.0mg/L的吲哚乙酸及大约2％的作为碳源的蔗糖。
23.用于蔷薇属幼苗的增殖的培养基，其包含大约2mg/L的苄基腺嘌呤，大约0.05mg/L萘乙酸及大约2％的作为碳源的蔗糖。
24.用于诱导蔷薇属植株花芽的培养基，其包含至少一种选自苯基噻二唑脲、激动素及玉米素的细胞分裂素；萘乙酸浓度大约为0.5mg/L；作为碳源的3％的蔗糖；以及大约400mg/L的肌醇。
25.权利要求22，23或24中任一项的培养基，其进一步包含营养培养基。
26.权利要求25的培养基，其中所述营养培养基包含有MS培养基及Gamborg′sB5维生素。
27.权利要求26的用于诱导蔷薇属植株花芽的培养基，其包含大约0.4至0.5mg/L的苯基噻二唑脲，大约0.5mg/L的萘乙酸，大约0.1mg/L的激动素，3％作为碳源的蔗糖，以及大约400mg/L的肌醇，但所述培养基中不包含玉米素。
28.权利要求26的用于诱导蔷薇属植株花芽的培养基，其包含大约0.5至1.0mg/L的玉米素，大约0.5mg/L的萘乙酸，3％作为碳源的蔗糖，大约400mg/L的肌醇，但培养基中不包含苯基噻二唑脲和激动素。
29.权利要求24的培养基，其中所述蔷薇属植株是蔷薇属杂交品种。
30.权利要求29的培养基，其中所述蔷薇属杂交品种选自桔红PARADE，假日PARADE，鲜红PARADE，比安卡PARADE、霜白PARADE的栽培品种。
31.用于蔷薇属栽培品种的微繁殖及使所述蔷薇开花的方法，其包含(a)从成熟蔷薇属植株或者蔷薇属的组织培养物中取材，在无菌的条件下制备幼枝；(b)在密闭容器中的第一培养基上培养所述幼枝，所述的第一培养基包含细胞分裂素、植物生长素以及作为碳源的蔗糖以用于产生有芽的外植体；(c)将芽从外植体上移除；(d)在密闭容器中的所述第一培养基上进行芽的繁殖以产成具有新生芽的幼苗；(e)在密闭容器中的所述第一培养基上增殖所述幼苗；以及(f)在密闭容器中的所述第一培养基上培养所述经过增殖的幼苗。
全文摘要
本发明涉及用于蔷薇属植株的微繁殖和体外诱导所述蔷薇属植株开花的组合物和方法。在含有第一培养基的密闭容器中诱导幼枝产生芽，所述第一培养基包含苄基腺嘌呤、植物生长素及2％作为碳源的蔗糖。将芽切下并培养在用于幼苗繁殖和增殖的培养基上。然后，将幼苗移入含有苯基噻二唑脲、植物生长素及肌醇的培养基上以诱导花芽，继而在含有苄基腺嘌呤及植物生长素的培养基上培养以使幼苗伸长，最后在不含植物激素的第五培养基上培养使之开花。或者，在繁殖和增殖之后，将幼苗移入含有玉米素、植物生长素及肌醇的培养基上以诱导开花，然后培养于不含植物激素的培养基上使之伸长并开花。
文档编号A01H4/00GK1455640SQ00820009
公开日2003年11月12日申请日期2000年11月9日优先权日2000年11月9日
发明者洪焰, 袁梅芳, 王光远申请人:分子农业生物学院