花青素提取方法总结

1、1 玉米籽粒花青素提取和分析方 法 2 花青素是植物中的主要呈色物质，属于类 黄酮化合物 自然状态下很少以游离态存在，常与一个 或多个多糖通过糖苷键形成糖苷 已知有20多种花青素，植物中常见的有六 种：天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色 素、芍药色素、牵牛花色素、锦葵色素 （其最大可见光吸收波长分别为494、506、 508、506、508和510 nm） 3 花青素的生理功能 消除自由基、抗氧化 紫玉米花色苷具有很高的抗氧化活性和抗 菌活性，甚至高于蓝莓的抗氧化活性。 抗诱变、肿瘤、过敏 抑制食品诱变剂，对结肠癌细胞有抑制作 用 降血脂 4 花青素的结构特点 现已查明,天然花色苷糖苷配基的基本

2、 结构为3 ,5 ,7 - 三羟基- 2 - 苯基苯并吡喃,结构式为: 5 花青素的稳定性影响因素 结构 C3羟基可使分子变得不稳定，C5上有羟基或 C4发生取代都可使颜色趋于稳定 糖苷的形成也影响花色苷的稳定性 花色苷的酰基化显著增加其在微酸性至中 性介质中的稳定性 6 温度 PH 醌型 碱 黄烊盐 阳离子 假碱 查尔酮 7 温度 当花色苷溶液加热时,平衡向着无色的查耳 酮(C) 的方向进行,同时引起有色型化合物 (AH+ + A) 的降低。当冷却和酸化时,醌型碱 (A) 和假碱(B) 迅速变成阳离子(AH+ ) 。花色 苷在温度小于 60的条件下较为稳定，当 温度大于 80时，温度对花色苷

3、有较明显 的降解作用； 光对花色 苷的稳定性影响 很大 8 辅色剂的影响 花色苷同辅色剂联合形成一种垂直层叠的 复合物(Goto 等1979) ,这种层叠过程产生一 种疏水力,从而防止亲水核的加合作用和失 色。 9 提取方法： 一、萃取 溶剂法 常用的溶剂主要分为3类:水、亲水性有机溶 剂和亲脂性有机溶剂。为防止花色苷的降 解和提高花色苷的溶出率,常在溶剂中加少 量的无机酸或有机酸，使提取液的p H 控制 在3.15 以下。 10 l这是目前国内外广泛使用的提取方法，多 数选择甲醇、乙醇、丙酮或它们的混合溶 剂对材料中的花青素进行溶解过滤，通过 酸或碱调节溶液酸碱度萃取滤液中的花青 素。 l该

4、方法原理简单，对设备要求较低，不足 之处是大多数有机溶剂毒副作用大且产物 提取率低。 有机溶剂萃取法 11 水溶液提取法 该方法一般在常压或高压下用热水浸泡含 花青素的原材料，然后用非极性大孔树脂 进行吸附；或直接使用脱氧热水提取，再 采用超滤或反渗透经浓缩得到粗提物 陆国权等 研究表明，提取脚板薯花青素的 最佳方法是：以05 硫酸溶液作浸提剂， 并使其pH440，在6O下加热60 min。 设备简单，无污染，产品无毒但纯度低。 12 超临界流体萃取法 利用压力和温度对超临界流体溶解能力的 影响进行提取。 最大的优点是产品提取率高，可以低温操 作，避免了不饱和脂肪酸的氧化分解，溶 剂无残留，且

5、作为超临界流体的CO2易得， 萃取能耗低。 时海香等人研究了超临界CO2 萃取常山胡柚 天然色素的工艺，色素提取率可达96.187 % 13 提取方法： 二、破除细胞壁 发酵提取法 原理是:通过微生物的作用使紫甘薯中的 淀粉转化为乙醇,将乙醇分离后,可得到紫甘 薯花色苷,原料的利用率大大提高。 其利用微生物破坏细胞壁和细胞膜,促进 花色苷的溶出,提高提取率。通过发酵分解 色素液中的糖、有机酸和其他杂质,大大降 低了色素的纯化难度。 14 酶法提取 用于花色苷提取的酶主要有纤维素酶和果 胶酶,通过酶解使植物细胞壁软化、膨胀及 崩溃,从而促进了花色苷的溶出。 王萍等人通过单因素和正交试验,确定了黑

6、 加仑果渣花色苷酶法提取的的最佳工艺， 黑加仑花色苷提取率的91.109 %, 此法可以大大缩短花色苷提取时间,提高得 率。 15 辅助方法 超声波辅助提取 在超声波声场中,振动负压区由于周围的液体来 不及补充,形成无数的微小真空泡,而当正压来到时, 微小气泡在压力下突然闭合,液体间猛烈碰撞产生 极大的冲击波,压力可高达3 000 MPa ,从而使植物 细胞破裂,利于花色苷的溶出。 此法具有提取时间短,设备简单,操作方便等优点, 并可有效防止热敏性成分的高温分解。 16 微波辅助提取 当微波加热时,细胞内极性物质尤其是水分 子吸收微波能,产生大量的热量使细胞内温 度迅速上升,液态水汽化产生的巨

7、大压力将 细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞,使胞 外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放出胞内 物质。 与传统方法相比,微波法具有提取率高、时 间短、能耗小等优点,因此微波用于天然素 的提取工艺具有广阔的应用前景。 17 其他辅助方法 高压脉冲电场辅助提取 高压脉冲电场辅助提取法是一种新型非热技术,它 具有提取温度低、速率快、时间短、提取率高、 产品品质好的特点。 液态静高压法辅助提取 Corrales 等人用液态静高压辅助提取的方法从葡萄 皮中提取花色苷,研究所得的最优工艺参数是:100 %乙醇,温度50 ,压力600 MPa 。此法与未使用 HHP 法相比,产率提高23 %。H HP 具有提取

8、温度低, 时间短,不破坏色素结构等优点,但应用于花色苷等 活性成分提取的报道还不多见。 18 提取条件比较 19 20 纯化 经过提取的花色苷粗品中往往含有很多有机 酸、糖等杂质,产品质量稳定性差、纯度不 高。为了提高产品的色价和稳定性,需要对 提取物进一步纯化。 21 柱层析法 凝胶柱层析 聚酰胺层析 硅胶层析 离子交换层析 22 大孔树脂层析 大孔树脂是近代发展起来的一类有机高聚 物吸附剂。分离工艺得到的提取物不吸潮， 工艺简单，成本相对较低，树脂可反复使 用适合工业化生产 杨迎花等 采用大孔树脂吸附纯化葡萄籽原 花青素，结果表明大孔树脂吸附纯化工艺 简单、成本低、产率高、安全适用。 23

9、 膜分离法 花色苷提取中常用的膜分离技术有超滤(UF) 、反 渗透(RO) 、电渗析( ED) 等。 Patil 用酸化的乙醇提取红萝卜花色苷,随后用膜分 离的方法有效的脱醇并浓缩了花色苷提取液,使花 色苷含量从37216 mg/ L 提高到62518 mg/ L 膜分离纯化的花色苷色价和透明度高,稳定性好,容 易实现连续化生产,生产过程劳动强度低,流程简单, 但对设备要求高,纯化成本高,提取效率低。 24 鉴定 经过加工或储藏的材料会产生褐色降解物经过加工或储藏的材料会产生褐色降解物, 这些降解物和花色苷具有相同的能量吸收这些降解物和花色苷具有相同的能量吸收 范围范围. 这类花色苷总量的测定

10、这类花色苷总量的测定,通常有两种方通常有两种方 法法 pH示差法示差法 差减法差减法 25 鉴定方法 柱层析 薄层层析 光谱分析法 HPLC、MS、HPLCMS 核磁共振法 毛细管区带电泳法 26 紫外可见光谱法 色素的紫外吸收光谱是色素的重要特征。 吸收光谱是鉴定和测量混合物中主要色素 的最简单方法。其主要原理是依据花色苷 的不同基团的在不同的波长下有不同的吸 收峰,进而推断出其结构。 B环有邻位羟基的确定。糖基位置的确 定。酰基是否存在的确定。甲基化与 羟基化 27 HPLC 高效液相色谱法( HPLC) 以经典的色谱法为基础,引 入了气相色谱法的理论和实验方法,流动相改为高 压输送,采用

11、高效固定相及在线检测手段发展而成 的一种高效快速分离分析技术。 HPLC 可以在30min 一个流程内分离15种不同的花 色苷,其分辨能力远远超过纸层析和薄层层析。但 是,由于缺乏花色苷的标准对照品,使得仅靠HPLC 方法对花色苷进行定性和定量分析还不够充分。 28 出峰顺序 9种花色素苷的出峰顺序：花翠素3O一葡 萄糖苷、花青素3-0葡萄糖苷、3一甲花 翠素3O葡萄糖苷、甲基花青素 3O葡萄糖苷、二甲花翠素3O葡萄 糖苷、甲基花青素3O一(6一O一乙酰)葡萄 糖苷、二甲花翠素3O(6O乙酰)葡萄 糖苷、甲基花青素3O(6o-对香豆酰) 葡萄糖苷、二甲花翠素3O(60对香 豆酰)葡萄糖苷 29

12、 双标样高效液相色谱法测定紫玉米 花青素的含量 设备 Agilent 1 100高效液相色谱仪和Agilent Ion TrapXCT MS：美国安捷伦公司；Waters Xbridge C18(250 mmx46 mm，5 m)柱： 美国Waters公司 色谱流动相：A(5甲酸)，B(甲酸：水：乙 腈=5：45：50，体积比)；流速： 0.8mUmin;DAD检测器；柱温30；梯度洗 脱。 30 标样 C3G 和P3G（紫玉米花青素其主要以C3G 和 P3G 及其衍生物为主要组成部分） 结果 C3G 的加标回收率为93.7 %（RSD 为0.804 %）， 可以确定以C3G 为标样测定样品C

13、3G 含量更加准 确。同理，样品中P3G 及其衍生物以P3G 为标样 获得的结果更可靠。因此，使用双标样高效液相 色谱法获得的紫玉米花青素含量（93.77 mg/g）更 加准确。 P3G：芍药色素-3-葡萄糖 CG：矢车菊色素-3-葡萄糖苷 31 32 紫玉米花青素种类 近年来, 采用温和的提取分离方法和现代分析仪器手段如 TLC、HPLC、MS、NMR 等, Aok i等研究发现紫玉米籽粒中 含有8种花青苷: 矢车菊素- 3-葡萄糖苷、天竺葵素- 3-葡萄 糖苷、芍药素- 3-葡萄糖苷、两个矢车菊素- 3-丙二酸酰基 葡萄糖苷同分异构体、天竺葵素- 3-丙二酸酰基葡萄糖苷、 芍药素- 3-丙

14、二酸酰基葡萄糖苷、矢车菊素- 3-二丙二酸酰 基葡萄糖苷。 Zhao等对中国紫玉米杂交品种的籽粒进行了质谱分析, 初 步发现9个花青苷单体物质, 包括矢车菊素- 3-葡萄糖苷、 天竺葵素- 3-葡萄糖苷、芍药素- 3-葡萄糖苷、两个矢车菊 素- 3-丙二酸酰基葡萄糖苷同分异构体、天竺葵素- 3-丙二 酸酰基葡萄糖苷、两个芍药素- 3-丙二酸酰基葡萄糖苷同 分异构体、天竺葵素- 3-二丙二酸酰基葡萄糖苷。 33 含量 每100 g秘鲁紫玉米中含色素物质为1 640mg , 远远 高于鲜蓝莓花青苷的( 73 430mg) 。 籽粒表皮含大部分的花青苷, 通常为504 1473mg, 而Moreno等 发现, 在一些南美紫玉米品种( Arro cillo, Con ico, Peruano 和Purepecha)的脱胚芽玉 米籽粒中, 含54 115mg的花青苷。 Zhao等发现中国紫玉米杂交品种的籽粒中, 花青苷 高达305mg(以100 g干质量计, 下同)。 敬璞等研究发现秘鲁紫玉米芯花青苷含量高达 1333mg 34 初步的提取方案 提取(1): 酸醇提

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