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一种兜兰花粉低温干燥保存方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-09-18 07:28

技术领域：

本发明属于植物繁殖技术领域，具体涉及一种兜兰花粉低温干燥保存方法。

背景技术：
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兜兰(paphiopedilum)又叫拖鞋兰、仙履兰等，全世界有90多个种，主要分布于亚洲热带地区至太平洋岛屿。兜兰由于其独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值，是国际花卉市场上十分流行的高档花卉，在世界上具有大量的爱好者。但由于人们对兜兰的过度追逐而对野生资源进行了毁灭性的采挖，兜兰已成为世界上最濒危的植物物种之一，所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(cites)附录i而被禁止贸易。

兜兰杂交种比原生种姿态更为优美，生长势和抗逆性强，在花色上比原生种更为丰富多彩，也能在国际市场上进行交易，现已成为世界兜兰产业的主流产品。我国兜兰的杂交育种工作还刚刚起步，尽管我国具有丰富的兜兰资源(约有30多种)，然而许多兜兰种类及杂交种的花期不一致，它们之间不能利用新鲜花粉进行杂交育种。利用花粉的低温干燥保存技术能有效地解决这个问题，培育出大量的兜兰杂交种。

技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种保存时间长、花粉活力高的兜兰花粉低温干燥保存方法。

本发明的兜兰花粉低温干燥保存方法，包括以下步骤：在兜兰花朵完全展开的3-5天内，应用灭菌的挑取工具将其药帽打开，接着用该灭菌的挑取工具将兜兰花粉块挑至洁净无菌的容器中，在无菌状态下对花粉块进行脱水，然后将脱水后的花粉块密封好，置于4℃条件下避光保存。

具体步骤如下：在兜兰花朵完全展开的3-5天内，于上午10-12时应用灭菌的牙签轻轻将其药帽打开，接着用灭菌的牙签粘上兜兰花粉块并将其迅速放至洁净无菌的塑料离心管内，每管放入1个花粉块，立即将离心管盖上并密封好，然后将放置了花粉块的塑料离心管用一无菌的玻璃瓶集中装起来并密封好，在无菌状态下，将贮存花粉的塑料离心管的盖打开，管口盖上无菌的脱脂棉后放入具有硅胶粒干燥剂的玻璃瓶中脱水48-96小时，然后盖上塑料离心管盖再放置于4℃条件下避光保存。

所述的兜兰优选为海伦兜兰(paphiopedilumhelenae)或彩云兜兰(paphiopedilumwardii)。

利用本发明的方法保存兜兰花粉块，保存的时间可达6～12个月，经回暖回湿处理后，采用氯化三苯四氮唑(ttc)染色法测定花粉活力发现，该保存方法保存的花粉活力强，自交或杂交成功率高达90％～95％。本发明的方法解决了不同花期的兜兰品种和植株的杂交授粉阻碍，为我国兜兰新品种培育及其产业的进一步发展奠定基础，因此具有重大的社会效益和经济效益。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：海伦兜兰(paphiopedilumhelenae)保存花粉的自交授粉

(1)花粉的采集和保存

10月份，在海伦兜兰花朵完全展开3天时，于上午10时应用高温高压灭菌的牙签小心将其药帽打开，接着用灭菌的牙签粘上开花后花粉块并将其迅速放至洁净无菌的1ml塑料离心管内，每管放入1个花粉块，并立即将离心管管盖上和密封好。每取1个花粉块更换一个新的牙签。然后将放置了花粉块的离心管用一无菌的玻璃瓶集中装起来并密封好带回实验室。然后在无菌状态下，将贮存花粉的塑料离心管的盖打开，管口盖上无菌的脱脂棉后放入具有硅胶粒干燥剂的玻璃瓶中脱水48小时，然后盖上离心管盖再放置于4℃条件下避光保存。

(2)磷酸缓冲液和ttc溶液的配制

磷酸缓冲液(66mmol/l，ph7.0)的配制：a液称取na2hpo4·2h2o1.188g溶于蒸馏水中，定容至100ml；b液称取kh2po40.908g溶于蒸馏水中，定容至100ml；用时取a液60ml、b液40ml混合即可。

ttc溶液(0.5％)的配制：称取0.05gttc溶于磷酸缓冲液(66mmol/l，ph7.0)，并用磷酸缓冲液(66mmol/l，ph7.0)定容至10ml，置于冰箱闭光冷藏备用。

(3)低温干燥保存花粉的活力测定

第2年10月份，将4℃低温干燥保存12个月的装载花粉的离心管取出，在25℃室温下，在装载花粉的离心管加入3滴无菌水回暖回湿处理90分钟，然后干瘪的花粉块基本能恢复到原来的大小和颜色。

在干洁的载玻片上放少量回暖回湿处理的海伦兜兰花粉块，然后加1滴ttc溶液，静置20分钟。用滤纸将ttc溶液吸走，用玻璃棒小心将花粉块小心压成粉状，再滴上一滴ttc溶液，用解剖针搅匀花粉，盖上盖玻片，室温下静置2小时，光学显微镜(10×20)下观察镜检其ttc染色率为50％。

(4)低温干燥保存花粉的活力验证

在授粉前去掉开花3天的海伦兜兰花朵唇瓣和花粉块，用已灭菌的牙签粘取回暖回湿处理花粉块放置于海伦兜兰花朵蕊柱上进行自交，30天后统计其自交结实成功率为95％，与采用新鲜花粉自交结实成功率95％一致。

实施例2：海伦兜兰(paphiopedilumhelenae)保存花粉和杏黄兜兰的杂交授粉

(1)花粉的采集和保存

10月份，在海伦兜兰花朵完全展开的4天时，于上午11时应用高温高压灭菌的牙签小心将其药帽打开，接着用灭菌的牙签粘上开花后花粉块并将其迅速放至洁净无菌的1ml塑料离心管内，每管放入1个花粉块，并立即将离心管管盖上和密封好。每取1个花粉块更换一个新的牙签。然后将放置了花粉块的离心管用一无菌的玻璃瓶集中装起来并密封好带回实验室。然后在无菌状态下，将贮存花粉的塑料离心管的盖打开，管口盖上无菌的脱脂棉后放入具有硅胶粒干燥剂的玻璃瓶中脱水72小时，然后盖上离心管盖再放置于4℃条件下避光保存。

(2)磷酸缓冲液和ttc溶液的配制

ttc溶液(0.5％)的配制：称取0.05gttc溶于磷酸缓冲液(66mmol/l，ph7.0)，并用磷酸缓冲液(66mmol/l，ph7.0)定容至10ml，置于冰箱闭光冷藏备用。

(3)低温干燥保存花粉的活力测定

4月份时，将4℃低温干燥保存6个月的装载花粉的离心管取出，在28℃的水浴条件下加入2滴无菌水回暖回湿处理60分钟，然后干瘪的花粉块基本能恢复到原来的大小和颜色。

在干洁的载玻片上放少量回暖回湿处理的兜兰花粉块，然后加2滴ttc溶液，静置30分钟。用滤纸将ttc溶液吸走，用玻璃棒小心将花粉块小心压成粉状，再滴上一滴ttc溶液，用解剖针搅匀花粉，盖上盖玻片，室温下静置3小时，光学显微镜(10×20)下观察镜检其ttc染色率60％。

(4)低温干燥保存花粉的活力验证

用已灭菌的牙签粘取回暖回湿处理海伦花粉块放置于开花4天的杏黄兜兰花朵的蕊柱上进行杂交，30天后统计其自交结实成功率为90％，与采用新鲜花粉自交结实成功率90％一致。

实施例3：彩云兜兰(paphiopedilumwardii)保存花粉和紫纹兜兰的杂交授粉

(1)花粉的采集和保存

12月时，在彩云兜兰花朵完全展开的5天时，于上午12时应用高温高压灭菌的牙签小心将其药帽打开，接着用灭菌的牙签粘上开花后花粉块并将其迅速放至洁净无菌的1ml塑料离心管内，每管放入1个花粉块，并立即将离心管管盖上和密封好。每取1个花粉块更换一个新的牙签。然后将放置了花粉块的离心管用一无菌的玻璃瓶集中装起来并密封好带回实验室。然后在无菌状态下，将贮存花粉的塑料离心管的盖打开，管口盖上无菌的脱脂棉后放入具有硅胶粒干燥剂的玻璃瓶中脱水96小时，然后盖上离心管盖再放置于4℃条件下避光保存。

(2)磷酸缓冲液和ttc溶液的配制

ttc溶液(0.5％)的配制：称取0.05gttc溶于磷酸缓冲液(66mmol/l，ph7.0)，并用磷酸缓冲液(66mmol/l，ph7.0)定容至10ml，置于冰箱闭光冷藏备用。

(3)低温干燥保存花粉的活力测定

第二年10月份时，将4℃低温干燥保存10个月的装载花粉的离心管取出，在30℃的水浴条件下加入2滴无菌水回暖回湿处理45分钟，然后干瘪的花粉块基本能恢复到原来的大小和颜色。

在干洁的载玻片上放少量回暖回湿处理的兜兰花粉块，然后加2滴ttc溶液，静置40分钟。用滤纸将ttc溶液吸走，用玻璃棒小心将花粉块小心压成粉状，再滴上一滴ttc溶液，用解剖针搅匀花粉，盖上盖玻片，室温下静置4小时，光学显微镜(10×20)下观察镜检其ttc染色率70％。

(4)低温干燥保存花粉的活力验证

用已灭菌的牙签粘取回暖回湿处理海伦花粉块放置于开花5天的紫纹兜兰花朵的蕊柱上进行杂交，30天后统计其自交结实成功率为95％，与采用新鲜花粉自交结实成功率95％一致。