植物药物灯盏花素的人工生物合成

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目录

第1章引言

1．1合成生物学在植物天然产物领域的研究进展

1．1．1关键基因挖掘

1．1．2合成途径的构建与优化

1．2黄酮类化合物生物合成研究进展

1．2．1黄酮类化合物简介

1．2．2黄酮类化合物生物合成途径

1．2．3酪氨酸和苯丙氨酸代谢工程改造

1．2．4丙二酰-辅酶A代谢工程改造

1．3灯盏花素研究进展

1．3．1灯盏花素简介

1．3．2灯盏花素的植物提取

1．3．3灯盏乙素的化学合成

1．3．4灯盏花素的生物合成途径研究进展

1．4本课题的研究目的及思路

第2章灯盏花素前体的生物合成

2．1实验材料

2．1．1质粒、菌株与引物

2．1．2实验仪器

2．1．3实验试剂

2．1．4感受态、工具酶和试剂盒

2．1．5反应溶液

2．1．6培养基

2．2实验方法

2．2．1 PCR扩增反应

2．2．2琼脂糖凝胶电泳

2．2．3纯化回收DNA扩增片段

2．2．4 DNA及RNA浓度测定

2．2．5 Golden gate cloning

2．2．6 pEASY-Blunt连接

2．2．7大肠杆菌转化

2．2．8菌落PCR验证

2．2．9质粒抽提

2．2．10酵母细胞的转化方法

2．2．11酵母细胞基因组提取

2．2．12芹菜素标准曲线制备

2．2．13发酵及产物检测方法

2．3实验结果与讨论

2．3．1基因重注释

2．3．2 Golden gate克隆载体的构建

2．3．3芹菜素底盘细胞构建

2．3．4芹菜素发酵生产

2．4本章小结

第3章黄酮7-糖基转移酶筛选与灯盏甲素合成

3．1实验材料

3．1．1质粒、菌株与引物

3．1．2实验仪器

3．1．3实验试剂

3．1．4感受态、工具酶和试剂盒

3．1．5反应溶液

3．1．6培养基

3．2实验方法

3．2．1 PCR扩增反应

3．2．2酶切反应

3．2．3 DNA琼脂糖凝胶电泳

3．2．4连接反应

3．2．5连接产物转化感受态细胞

3．2．6菌落PCR验证

3．2．7大肠杆菌质粒抽提

3．2．8 EbF7GAT蛋白的表达

3．2．9蛋白的纯化方法

3．2．10 SDS-PAGE电泳检测

3．2．11蛋白浓度的检测

3．2．12体外酶活检测

3．2．13酶动力学参数测定

3．2．14酵母质粒提取

3．2．15发酵及产物检测方法

3．3实验结果与讨论

3．3．1糖基转移酶进化关系

3．3．2重组质粒pET28a-EbF7GAT的构建

3．3．3 EbF7GAT蛋白表达及功能鉴定

3．3．4 EbF7GAT体外酶活检测

3．3．5 EbF7GAT酶动力学参数测定

3．3．6 EbUDPGDH功能鉴定

3．3．7灯盏甲素发酵生产

3．4本章小结

第4章黄酮6-羟化酶筛选与灯盏乙素合成

4．1实验材料

4．1．1质粒、菌株与引物

4．1．2实验仪器

4．1．3实验试剂

4．1．4感受态、工具酶和试剂盒

4．1．5反应溶液

4．1．6培养基

4．2实验方法

4．2．1灯盏花RNA提取

4．2．2 cDNA文库构建

4．2．3 P450酶注释

4．2．4 Gibson组装

4．2．5 P450酿酒酵母转化

4．2．8高压匀浆法细胞破碎

4．2．9微粒体提取

4．2．10微粒体反应

4．2．11两步法基因无痕敲除

4．2．12植物中黄酮提取

4．2．13黄酮类化合物胞内外产量比例的测定

4．2．14产物纯化制备与NMR检测

4．2．15分批补料发酵培养

4．3结果分析

4．3．1已报道F6H灯盏花中同源序列功能鉴定

4．3．2各物种灯盏乙素的分布

4．3．3各物种P450酶注释

4．3．4 P450酶生物信息学分析

4．3．5 P450酶高通量筛选

4．3．6 P450酶微粒体实验

4．3．7 6位羟基化功能鉴定

4．3．8黄酮产物分布

4．3．9 CYP706家族候选基因功能鉴定

4．3．10代谢工程改造与灯盏花素发酵生产

4．4本章小结

第5章F6H同工酶筛选与定向改造

5．1实验材料

5．1．1质粒、菌株与引物

5．1．2实验仪器

5．1．3实验试剂

5．1．4感受态、工具酶和试剂盒

5．1．5反应溶液

5．1．6培养基

5．2实验方法

5．2．1植物材料

5．2．2半枝莲转录组建库与测序

5．2．3转录组组装与基因注释

5．2．4跨膜区预测

5．2．5同源建模

5．2．6分子模拟对接

5．2．7定点突变

5．2．8载体构建

5．2．9酵母细胞转化方法

5．3．2半枝莲转录组分析

5．3．3 CYP82D亚家族与UGT88家族基因预测

5．3．4 CYP82D亚家族候选基因功能鉴定

5．3．5同源建模

5．3．6分子模拟对接

5．3．7 F6H定点突变与功能解析

5．3．8 UGT88家族候选基因功能鉴定

5．3．9 F6H和F7GAT组合表达

5．4本章小结

第6章结论与展望

6．1全文总结

6．2展望

参考文献

附录

致谢

作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果

相关知识

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