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一种铁皮石斛类纤维素合成酶蛋白及其编码基因和应用

来源：花匠小妙招时间：2025-08-28 20:40

本发明涉及生化，尤其涉及一种铁皮石斛类纤维素合成酶蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

1、铁皮石斛(dendrobium catenatum lindl.)为兰科多年生草本植物，具有益胃生津、滋阴清热等功效。现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗肿瘤、降血压、降血脂等作用，同时还兼具抗氧化、提高机体免疫力等功能，因此被广泛应用于功能保健产品、医药领域及化妆品的开发。由于铁皮石斛由于生长繁殖缓慢，加上生境及野生资源大规模破坏等原因，野生石斛濒临绝迹。近年来，随着铁皮石斛组织培养技术的发展，特别是仿野生栽培模式的应用，其种植规模得到突破，但在人工仿野生栽培过程中，低温等非生物胁迫是制约其产业化发展的主要瓶颈。因而，挖掘铁皮石斛抗低温的关键基因，阐明其响应规律，对提升产量与质量有重要作用。

2、细胞壁作为植物抵御环境变化的第一道屏障起着至关重要的作用，其中纤维素和半纤维素是植物细胞壁的主要成分，在各种非生物胁迫过程中发挥作用。类纤维素合酶蛋白(cellulose synthase like，csl)调节多种细胞壁多糖的合成，在植物生长和逆境响应中起关键作用。csl家族被分为多个亚家族，如csla、cslb、cslc、csld、csle和cslg。目前，在参与细胞壁多糖的合成的csl家族中，仅有csld、csla、cslc、cslf及cslh亚家族中的部分基因功能被研究。其中，csld与cesa(cellulose synthase)基因家族的序列相似性最高。然而，csl蛋白参与冷反应的调控机制尚不清楚，有待于进一步研究。

3、因此,本领域的技术人员致力于开发一种具有在低温胁迫下存在表达特性的铁皮石斛csl蛋白及其编码基因，并培育出具有抗逆性、优质的转基因植株，为定向培育耐低温石斛新品种提供理论基础和基因资源。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种具有在低温胁迫下存在表达特性的铁皮石斛csl蛋白及其编码基因，并培育出具有抗逆性、优质的转基因植株。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种铁皮石斛类纤维素合成酶dccsld2，其编码基因核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、进一步地，dccsld2氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明还提供了一种类纤维素合成酶dccsld2基因的克隆方法，包括以下步骤：

5、步骤1、将铁皮石斛幼苗培养两周后取样，提取总rna；

6、步骤2、将步骤1得到的总rna通过反转录合成cdna；

7、步骤3、以步骤2得到的cdna为模板，上游引物序列为：f：5’-atgatgtatccggagcaag-3’，下游引物序列为：r：5’-tcaggggaaagagaaggaa-3’，进行pcr扩增；扩增片段凝胶电泳结束后回收产物并连接至克隆载体pmd18-t，转化大肠杆菌dh5α，鉴定后测序。

8、进一步地，步骤3中pcr扩增的反应体系为：25μl体系，内含2×primestar maxpremix(购自takara)12.5μl，10μmol/l的引物f和引物r各1μl，cdna 2μl，ddh2o补足至25μl。

9、进一步地，步骤3中pcr扩增的反应条件为：预变性94℃5min；98℃10s,58℃30s,72℃2min,30个循环；72℃延伸5min。

10、本发明还提供一种类纤维素合成酶dccsld2基因转化拟南芥的方法，包括以下步骤：

11、步骤1)以含有基因dccsld2的质粒为模板，构建植物表达载体：phb-yfp-dccsld2农杆菌；

12、步骤2)将步骤1)得到的phb-yfp-dccsld2农杆菌菌株的单克隆添加至含有抗生素的lb液体培养基中，置于摇床上培养至od600为1.2，离心收集菌液，并调整菌液至od600为0.8，得到浸花用菌液；

13、步骤3)采用浸花法，在步骤2)得到的浸花用菌液中处理花序，暗培养24小时后恢复光照条件；转化植株经28天生长期后停止营养供给，待种荚自然成熟后收集t0代种子；通过除草剂筛选t2、t3代株系。

14、进一步地，步骤3)还包括浸花用菌液在接种前添加缓冲剂和表面活性剂。

15、进一步地，缓冲剂为mes；表面活性剂为吐温-20。

16、本发明还提供一种类纤维素合成酶dccsld2基因转化酵母的方法，包括以下步骤：以含有基因dccsld2的质粒为模板，设计带有特异性酶切位点的引物进行pcr扩增并将其连接至pyes2载体上，双酶切产物胶回收后将其与同样限制性酶切位点的线性化pyes2载体链接，转化大肠杆菌，菌液pcr验证后提取质粒，转化酵母感受态。

17、本发明还提供一种类纤维素合成酶基因dccsld2在定向培育耐低温石斛新品种的应用。

18、在本发明的较佳实施方式1中，详细说明了dccsld2基因的克隆及序列分析的过程；

19、在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明了dccsld2在不同组织及低温下的相对表达量分析过程；

20、在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明了dccsld2在烟草表皮细胞中的亚细胞定位过程；

21、在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明了dccsld2基因转化拟南芥和酵母的过程；

22、在本发明的另一较佳实施方式5中，详细说明了dccsld2转基因植株和酵母低温表型分析过程。

23、本发明有益的技术效果如下：

24、本发明首次报道csld家族基因调控药用植物非生物胁迫应答。通过克隆dccsld2基因，亚细胞定位分析，低温下dccsld2表达变化分析以及转基因植物低温表型分析。证明该基因是一个与铁皮石斛低温应答密切相关的类纤维素合酶基因，该基因在茎中高表达，且定位在高尔基体中，可提高转基因植物对低温的耐受性。本发明为其有效应用提供依据，对提高植物的抗低温能力，培育优质、高抗新品种具有重要意义。

25、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

技术特征：

1.一种铁皮石斛类纤维素合成酶dccsld2，其特征在于，所述dccsld2的编码基因核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.如权利要求1所述的类纤维素合成酶dccsld2，其特征在于，所述dccsld2氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.如权利要求1所述的类纤维素合成酶dccsld2基因的克隆方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3中所述pcr扩增的反应体系为：25μl体系，内含2×primestar max premix 12.5μl，10μmol/l的引物f和引物r各1μl，cdna2μl，ddh2o补足至25μl。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3中所述pcr扩增的反应条件为：预变性94℃5min；98℃10s,58℃30s,72℃2min,30个循环；72℃延伸5min。

6.如权利要求1所述的类纤维素合成酶dccsld2基因转化拟南芥的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3)还包括所述浸花用菌液在接种前添加缓冲剂和表面活性剂。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲剂为mes；所述表面活性剂为吐温-20。

9.如权利要求1所述的类纤维素合成酶dccsld2基因转化酵母的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以含有基因dccsld2的质粒为模板，设计带有特异性酶切位点的引物进行pcr扩增并将其连接至pyes2载体上，双酶切产物胶回收后将其与同样限制性酶切位点的线性化pyes2载体链接，转化大肠杆菌，菌液pcr验证后提取质粒，转化酵母感受态。

10.如权利要求1所述的类纤维素合成酶基因dccsld2在定向培育耐低温石斛新品种的应用。

技术总结
本发明公开了一种铁皮石斛类纤维素合成酶蛋白及其编码基因和应用，涉及生化技术领域。该蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；克隆方法为：将铁皮石斛幼苗培养两周后取样，提取总RNA；通过反转录合成cDNA；并以此为模板，设计引物，进行PCR扩增；扩增片段凝胶电泳结束后回收产物并连接至克隆载体pMD18‑T，转化大肠杆菌DH5α，鉴定后测序；该基因转化拟南芥和酵母；该基因可应用于定向培育耐低温石斛新品种。本发明对提高植物的抗低温能力，培育优质、高抗新品种具有重要意义。

技术研发人员：吕爱敏,邵清松,侯泓言,赵晨柠,彭文渊
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：
技术公布日：2025/8/21