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花粉培养方法案例.ppt

来源：花匠小妙招时间：2024-10-03 21:08

花粉培养花粉培养(pollen culture):也叫小孢子培养(microspore culture),是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.始于1953年。特点： 1、可排除花药培养中花丝、药壁等体细胞的干扰； 2、一个花药中花粉数目巨大，可减少试验用材料； 3、花粉除数量多，还具有单细胞、单倍性和较高同步性特点。 1) 花药培养形成单倍体植株。但花药中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。 2）经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株的存在。 3）激素对倍性变化有很大影响。单倍体的鉴定方法鉴定花粉植株染色体倍性的方法有：形态鉴定结实性鉴定染色体数目鉴定遗传标记鉴定。 * 植物花粉培养花粉培养选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）预培养数天取花药接种分离花粉通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质药壁向花粉提供营养物质；低温预处理消毒过滤离心再生培养材料的选取与制备（一）材料选择（二）预处理（三）外植体制备及接种（一）材料选择 1. 花粉发育时期的选择并不是任何发育时期的花粉都可直接诱导产生愈伤组织或胚状体，选择发育到特定时期花粉的材料进行培养是成功的关键。 2.确定取材时间选择大致处于所需要花粉发育时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。 2. 生理状态的选择花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接影响。比如大田栽培还是温室栽培植株的花药；是主茎穗还是分蘖穗的花药。水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高。选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率以1-5℃预低温处理小麦小穗，能提高花粉愈伤组织的产量。例：在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。各种植物要求预处理的温度和时间不同。（二）预处理（三）外植体制备及接种花粉培养中的表面灭菌通常先用70％乙醇浸润花蕾30S左右，然后在饱和漂白粉溶液（上清液）中浸泡10～20min ，或在0.1％氯化汞溶液中处理5～10分钟，之后用无菌水漂洗3～5次。花粉粒的游离分离花粉粒，应达到以下标准a：成活率较高，发育齐整 b：达到一定的数量 c：无菌，无杂质常用的分离方法有：A是自然散粉法a 固体培养把花药从未开的花中在无菌条件下，直接插接在无菌培养基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，使花粉继续培养生长。 b、液体培养这一方法可以和预培养结合进行，一般是将消毒后的花药接种在液体培养基中，在一定的温度条件下进行振荡培养，让花粉从花药中自行散落到培养基中，过筛再除去花药壁等，离心收集花粉将其重新培养在新鲜培养基上。 B、机械分离花粉粒 a：挤压法。此方法是将花药消毒后，加入少量的分离溶液，用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来，通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片，收集悬浮液，然后用30％蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。注意（a）挤压时用力要适当而且均匀（b）选用合适的筛网孔径（c）分离液的渗透压要合适b、搅拌器或超速旋切机法将小花放在含有一定培养液的微量搅拌器中，在高速条件下搅拌一定时间，匀浆用筛网过滤，滤液在1000g离心，用培养液洗涤数次，用percoll（包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒）密度梯度离心收集花粉微室培养平培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花粉胚状体，最终分化为植株。液体培养: 悬浮培养，通气性差。双层培养：上-液体+下-固体看护培养：花粉-滤纸-固体培养基微室培养：条件培养：在花药培养基中加入失活的花药提取物。花粉培养的方式：基本培养基植物种类不同对培养基的要求不同。如：培养基中高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。铁对花粉胚发育很重要。培养基分化培养：根据培养目的，调节植物激素分化培养：降低生长素,提高细胞分裂素--有利于芽的形成壮苗培养：同时下降，有利于胚状体的正常生长。植物激素的种类