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基于HPLC

来源：花匠小妙招时间：2025-08-14 02:14

摘要: 目的采用高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS/MS)法对广枣醇提物的主要化学成分进行分析鉴定。方法采用回流提取法制备广枣醇提物,以Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱为分析柱,并以0.2%甲酸-甲醇溶液为流动相,流速0.7 mL/min,柱温30℃,进样量25 μL,进行梯度洗脱;质谱采用电喷雾离子源,毛细管电压4.0 kV,干燥器流速10.0 L/min,干燥器温度350℃,雾化器压力35.0 psi(1 psi=6 894.8 Pa),正负离子模式下扫描采集数据,并对各主要色谱峰进行归属。结果通过正负离子质谱信息及元素组成分析,并结合相关文献和对照品数据对照,共鉴定出42种化合物,主要为氨基酸类、有机酸类及黄酮类,其中首次在广枣中发现的成分有17种。结论 HPLC-Q-TOF-MS/MS兼具色谱的高分离特性和质谱的高灵敏度双重优势,能对广枣的主要化学成分进行定性分析,可为广枣药效物质的基础研究提供依据。

HPLC-Q-TOF-MS/MS-based analysis of chemical constituents in Choerospondiatis fructus

YANG Lu-meng1 , YANG Ling-jian1, JIA Pu1, LAN Wei1, ZHANG Ya-jun1, WANG Shi-xiang1, ZHANG Peng2 , ZHENG Xiao-hui1

Abstract: Objective To apply high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS/MS) method in analyzing and identifying the main components in the ethanol extract of Choerospondiatis fructus. Methods The ethanol extract of Choerospondiatis fructus was prepared by the refluxing methods, and the main components in the extracts were separated by the gradient elution method with Agilent TC-C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), methanol-0.2% formic acid as the mobile phase, at flow rate 0.7 mL/min, column temperature 30℃, and sample volume 25 μL. Mass spectrometry was applied for the qualitative analysis under the positive and negative ion modes and ESI ion source was used for mass spectra, Vcap 4.0 kV, drying gas 10 L/min, gas temperature 350℃, and nebulizer 35 psi (1 psi=6 894.8 Pa). The main chromatographic peaks were assigned by Q-TOF. Results Forty-two compounds were identified through direct comparison of both positive and negative ion mass data, the element composition analysis, the data of the literature and the information from reference substances, including amino acids, organic acids, and flavonoids. Among them 17 constituents have been firstly found in Choerospondiatis fructus. Conclusion HPLC-Q-TOF-MS/MS has the advantage of the efficient separation ability ofHPLC and highly sensitive detection of MS, and is capable of making a qualitative analysis of the main components in Choerospondiatis fructus, which provides an evidence for study.

Key words:Choerospondiatis fructus chemical components high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry qualitative analysis

广枣为漆树科南酸枣属植物南酸枣[Choerospondias axillaris(Roxb.)Burtt et Hill]的干燥成熟果实，性味甘、酸、平，有行气活血、养心安神之功[1]。广枣具有抗心肌缺血和心律失常、抑制血小板聚集、抗缺氧、清除自由基、抗氧化以及诱导细胞凋亡等多种药理作用，临床上常用于治疗气滞血瘀、胸痹作痛、心悸气短、心神不安等心血管疾病[2, 3, 4, 5, 6]。而广枣的化学成分及药效作用的物质基础尚不明确，因此对其化学成分的研究工作十分重要。高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法(HPLC-Q-TOF-MS/MS)是一种将色谱的高效在线分离与质谱的高灵敏度、高选择性完美结合的联用技术，能够准确快速地对药材化学成分进行定性分析。当前对广枣化学成分的研究基本按分离、提纯、鉴定的方式进行，很少采用液相色谱-质谱分析法[7]。本研究采用HPLC-Q-TOF-MS/MS法对广枣醇提物进行定性分析，用电喷雾电离源正离子模式和负离子模式对色谱流出物进行检测，通过高分辨质谱分析结合对照品数据、数据库及相关文献共鉴定了42个化合物，其主要成分为氨基酸类、有机酸类、黄酮类等物质，旨在为广枣的药效物质基础研究提供有力依据。

1 材料和方法 1.1 仪器

安捷伦科技公司1200 Series 型高效液相色谱系统，包括在线脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器；6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS/MS，配有采集与数据处理软件(mass hunter workstation software version B.04.00)。XS105Dual Range万分之一天平(瑞士METTLER-TOLEDO)。

1.2 试剂

没食子酸(批号110831-201204)、原儿茶酸(批号110809-201205)、原儿茶醛(批号110810-201007)、槲皮素(批号100081-200907)、熊果酸(批号110742-201220)、5-羟甲基糠醛(批号111626-201308)、儿茶素(批号110877-201203)等对照品均购于中国食品药品检定研究院；柠檬酸、对羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、水杨酸、鞣花酸等对照品均购于国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲醇及甲酸购于美国Fisher公司；实验用水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

广枣药材购于西安市万寿路药材市场，并由西北大学生命科学学院房敏峰副教授鉴定为漆树科植物南酸枣Choerospondias axillaris(Roxb.)的干燥成熟果实。

1.3 样品制备 1.3.1 混合对照品溶液的制备

分别精密称取没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、槲皮素、熊果酸、5-羟甲基糠醛和儿茶素、柠檬酸、对羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、水杨酸、鞣花酸对照品各20 mg，置于5 mL避光容量瓶，用甲醇定容，制成质量浓度为4 mg/mL的混合对照品溶液，连续2次4倍稀释至质量浓度为0.25 mg/mL，于4℃冷藏保存。

1.3.2 广枣醇提物的制备

将干燥至恒质量的广枣药材去核，将果肉粉碎，过40目筛。称取50 g样品4~6倍70%乙醇回流提取2次[8]，每次时间均为1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩至约20 mL，转移至25 mL容量瓶，加水定容，制得含生药质量浓度为2 g/mL的广枣乙醇提取液。将广枣醇取液稀释10倍，0.45 μm有机微孔滤膜过滤，取续滤液进行HPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

1.4 HPLC-Q-TOF-MS/MS条件 1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.2%甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱，0~15 min 10% B,15~60 min 10%~85% B,60~70 min 100% B；流速：0.7 mL/min；柱温：30℃；进样量：25 μL；柱后3∶1分流，1/4导入质谱进行定性分析。

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：4.0 kV；干燥气温度：350℃；干燥气流速：10 L/min；雾化气压力：35 psi(1 psi=6 894.8 Pa)；碎裂电压：135 V；正负离子模式下扫描检测，一级质谱扫描范围：100~1 000 m/z，二级质谱扫描范围：50~1 000 m/z；正离子模式下参比离子设置为m/z 121.050 9和922.009 8，负离子模式下参比离子设置为m/z 112.985 5和966.000 7。

2 结果

在拟定的分析条件下，广枣醇提物和混合对照品在正负离子模式下的总离子流图如图 1 和图 2所示。通过对正负离子模式下的一级、二级质谱图(图 3)进行分析，并根据保留行为结合数据库METLIN、Massbank和Human Metabolome Database (HMDB)及相关文献报道进行结构鉴定，共确定了42种成分(表 1)，其中已有报道的有25种成分，首次在广枣中发现的成分有17种。

图 1 广枣醇提物总离子流图 Fig 1 The total ion chromatogram of ethanol extract of Choerospondiatis fructus A： Positive mode； B： Negative mode. 1: Proline; 2: Quininic acid; 3: Malic acid; 4: Citric acid; 5: Isoleucine; 6: Succinic acid; 7: Leucine; 8: Tyrosine； 9: Monoglyceride citrate; 10: Chebulic acid; 11: Gallic acid; 12: Phenylalanie; 13: Methylcitrate; 14: 5-Hydroxymethylfurfural; 15: Methylcitrate; 16: Pantothenic acid; 17: Protocatechuic acid; 18: Comenic acid; 19: Triethyl citrate; 20: Triethyl citrate; 21: Protocratechualdehyde; 22: Dimeric catechin; 23: p-Hydroxybenzoic acid; 24: Catechinic acid; 25: 2-Isopropyl malic acid; 26: m-Hydroxybezoic acid; 27: Salicylic acid; 28: 6-Hydroxy indole lactic acid; 29: Ethyl gallate; 30: Scopoletin; 31: Quercetin-3-O-arab sugar-glucoid; 32: Methyl ellagic acid glucoside; 33: Dimethoxy ellagic acid glycosidase; 34: Hyperin; 35: Gallogen; 36: Quercetin-3’-O-rhamnoside; 37: Methylellagic acid; 38: Quercetin; 39: 3,3’-Dimethyl ellagic acid; 40: Stearic acid; 41: Dibutyl phthalate; 42: Ursolic acid

图 2 混合对照品总离子流图 Fig 2 The total ion chromatogram of the mixed reference solution A： Positive mode； B：Negative mode. 4: Citric acid; 11: Gallic acid; 14: 5-Hydroxymethylfurfural; 17: Protocatechuic acid; 21: Protocratechualdehyde; 23: p-Hydroxybenzoic acid; 24: Catechinic acid; 26: m-Hydroxybezoic acid; 27: Salicylic acid; 35: Gallogen; 38: Quercetin; 42: Ursolic acid

图 3 广枣化学成分二级质谱图 Fig 3 MS2 spectrum of chemical constituents in Choerospondiatis fructus A: Monoglyceride citrate; B: Quininic acid; C: 2-Isopropyl malic acid; D1: Methyl ellagic acid glucoside; D2: Dimethoxy ellagic acid; E: Chebulic acid; F: Comenic acid; G: Ethyl gallate; H: Dimeric catechin; I: Quercetin-3-O-arab sugar-glucoid; J: 5-Hydroxymethylfurfural; K: Pantothenic acid; L: 6-Hydroxy indole lactic acid; M: Scopoletin

表 1 广枣醇提物的HPLC-Q-TOF-MS/MS分析结果 Tab 1 HPLC-Q-TOF-MS/MS analysis results of ethanol extracts from Choerospondiatis fructus

2.1 氨基酸类成分

在正离子模式下，从广枣中鉴定出5种氨基酸，m/z分别为116.069 8、132.102 1、132.102 0、182.081 2、166.085 9，保留时间为4.7、8.7、9.3、9.8、17.4 min，在裂解过程中均易产生HCOOH (46)和NH3 (17)质谱二级特征碎片离子，是α-氨基酸特有的中性碎片丢失[9]。通过EIC扫描与METLIN数据库中的二级碎片离子峰对比，结合文献报道[4]，鉴定化合物1、8和12为脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。提取m/z 132.102 1色谱图有2个色谱峰，它们的二级碎片均为m/z 86 [M+H-46]+和m/z 69[M+H-46-17]+，保留时间为8.7和9.3 min，即说明化合物5和7是同分异构体，而化合物5裂解产生m/z 69的离子丰度远大于化合物7，并通过保留时间可判断化合物6的极性比化合物8大，同时根据文献报道[4]，可鉴定化合物5为异亮氨酸，7为亮氨酸。

2.2 有机酸类成分 2.2.1 脂肪酸及其衍生物

在负离子模式下，鉴定了12个脂肪酸及其衍生物。其中已报道的成分包括苹果酸(3)、柠檬酸(4)、琥珀酸(6)、柠檬酸甲酯(13，15)、柠檬酸乙酯(19，20)、硬脂酸(40)和熊果酸(42)。首次在广枣果肉中发现奎宁酸(2)、柠檬酸单甘油酯(9)和2-异丙基苹果酸(25)。通过对照品的保留时间、一级质谱和二级碎片信息结合文献报道[10]，确定化合物4为柠檬酸(m/z 191.019 8，保留时间8.4 min)。化合物13、15、20、9与柠檬酸有相同的离子碎片m/z 173和111，如图 3A，推测它们是柠檬酸衍生物。其中化合物13和15为柠檬酸甲酯的同分异构体，化合物19和20为柠檬酸乙酯的同分异构体。通过HMDB数据库比对推测化合物9为柠檬酸单甘油酯，化合物2、25分别为奎宁酸和2-异丙基苹果酸，见图 3B和图 3C，奎宁酸具体裂解途径如图 4。由图 3C和相关文献[10]，推测化合物3为苹果酸。按同样方法鉴定化合物6、40、42分别为琥珀酸、硬脂酸和熊果酸，其一级质谱和二级质谱信息均与数据库中的相应化合物一致。

图 4 奎宁酸裂解途径 Fig 4 Fragment pathway of quininic acid

2.2.2 芳香酸及其衍生物

在负离子模式下分析并鉴定了广枣中的15种芳香酸及其衍生物，其中已报道的芳香酸及其酯类包括没食子酸(11)、原儿茶酸(17)、对羟基苯甲酸(23)、水杨酸(27)、鞣花酸(35)、3，3-二甲基鞣花酸(39)、邻苯二甲酸二丁酯(41)。首次在广枣果皮中发现的芳香酸及衍生物分别为诃子次酸(10)、comenic acid(18)、原儿茶醛(21)、间羟基苯甲酸(26)、没食子酸乙酯(29)、甲基鞣花酸-葡萄糖苷(32)、二甲基鞣花酸-葡萄糖苷(33)、甲基鞣花酸(37)。与对照品比对，确定化合物11、17、21、23、26、27、35分别为没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛、对羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、水杨酸、鞣花酸，见图 2。化合物11裂解途径如图 5。提取离子m/z 137.024 5出现保留时间为31.2、34.2、35.9和37.5 min，理论分子式均为C7H6O3的4个色谱峰，即是同分异构体。根据METLIN数据库二级碎片信息、反相色谱出峰特点及相应对照品可知化合物21、23、26、27分别为原儿茶醛、对羟基苯甲酸、间羟基苯甲酸、水杨酸(图 2)。鞣花酸的质荷比m/z为300.999 6，从二级质谱图中可观察到含有特征离子m/z 299.997 3的3个色谱峰，分别标记为化合物35、37和39，其中35已证明为鞣花酸，推测化合物37和39是鞣花酸衍生物。根据二级碎片离子峰(图 3D1、3D2)，以及文献报道[11, 12]鉴定化合物37、39分别为甲基鞣花酸、3,3’-二甲基鞣花酸，裂解途径如图 6。化合物32和33分子离子峰分别为m/z 477.068 8、491.083 1，并且均中性丢失162的碎片峰m/z 315[M-H-glucoside]-和m/z 328[M-H-glucoside]-，可知是化合物37和39的葡萄糖苷类，即3-甲基鞣花酸-葡萄糖苷和3，3’-二甲基鞣花酸-葡萄糖苷，糖苷的结合位置需进一步研究确认(图 3D1、3D2)。化合物10根据m/z 355.031 6、分子式C14H12O11以及主要碎片离子m/z 337、249、205、193、163和133(图 3E)，推测为诃子次酸，与文献报道[12]一致。化合物18 [M+H]+为m/z 171.028 5，与没食子酸为同分异构体，其二级质谱图中的碎片离子与comenic acid的结构相符(图 3F),根据文献报道[13]，推测化合物18为comenic acid。化合物29 [M-H]-197.046 2、分子式C9H10O5以及主要碎片离子m/z 169[M-H-28]-，124，99，推测为没食子酸的衍生物，分子式比没食子酸的多C2H4(28)，即为没食子酸乙酯(图 3G)。

图 5 没食子酸乙酯裂解途径 Fig 5 Fragment pathway of ethyl gallate

图 6 二甲氧基鞣花酸-葡萄糖苷裂解途径 Fig 6 Fragment pathway of dimethoxy ellagic acid-glycosidase

2.3 黄酮类成分在正离子模式下，共分析并鉴定出6个黄酮类成分，分别是二聚儿茶素(22)、儿茶素(24)、槲皮素-3-O-(阿拉伯糖苷-葡萄糖苷)(31)、金丝桃苷(34)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(36)和槲皮素(38)。其中二聚儿茶素和槲皮素-3-O-(阿拉伯糖苷-葡萄糖苷)为首次在广枣中发现。通过与对照品的保留时间、一级质谱信息和二级碎片离子进行比对(图 2、图 3H)，结合文献报道[14, 15]，确定化合物24、36为儿茶素和槲皮素。化合物22的保留时间、准分子离子峰、计算分子式、二级碎片与文献报道中Procyanidin B的信息[16]一致，由此推测化合物22为二聚儿茶素(图 3H)，裂解途径如图 7。化合物31、34、36二级质谱图中均含有碎片离子m/z 303.050 8，即是槲皮素衍生物。二级碎片离子分别为[M+H-162-132]+、[M+H-162]+和[M+H-146]+，符合苷类的中性丢失规律，丢失162说明含有葡萄糖苷，丢失146说明含有鼠李糖苷，丢失132说明含有阿拉伯糖苷。参考文献报道[17, 18]可知化合物34为金丝桃苷，36为槲皮素-3-O-鼠李糖苷，其裂解途径如图 8。而化合物31根据文献报道[19]初步推测为槲皮素-3-O-(阿拉伯糖苷-葡萄糖苷)，阿拉伯糖苷和葡萄糖苷的结合位点仍有待进一步检测(图 3I)。

图 7 二聚儿茶素裂解途径 Fig 7 Fragment pathway of dimeric catechin

图 8 槲皮素-3-O-(阿拉伯糖苷-葡萄糖苷)裂解途径 Fig 8 Fragment pathway of quercetin-3-O-(arabinoside-glucoside)

2.4 其他化合物

利用HPLC-ESI-TOF-MS 所提供的保留时间、分子式和质谱碎片信息，参考文献研究结果，本实验还首次从广枣的醇提物中鉴定出5-羟甲基糠醛(14)、泛酸(16)、6-羟基吲哚乳酸(28)和东莨菪内酯(30)4个化合物。具体解析和归属过程如下：化合物14的分子离子峰、计算分子式、二级质谱碎片峰与文献报道中5-羟甲基糠醛的质谱信息[20]一致；最后通过与对照品比较后确认化合物14为5-羟甲基糠醛(图 3J)，其裂解途径如图 9。在正离子模式下可检测到化合物16和化合物30，通过在METLIN数据库检索并进行二级质谱图比对，最后初步推测化合物16为泛酸(图 3K)，化合物28为6-羟基吲哚乳酸(图 3L)，化合物30为东莨菪内酯(图 3M)。它们的确切结构还需采用其他分析手段进行验证。

图 9 5-羟甲基糠醛裂解途径 Fig 9 Fragment pathway of 5-hydroxymethylfurfural

3 讨论

参考2015年版《中华人民共和国药典》[1]中广枣主要指标成分没食子酸的分析条件，本实验选用了适用性广的C18色谱柱(Aglient TC-C18，4.5 mm×250 mm，5 μm)。通过考察不同浓度的甲酸比例及纯水比较得知，向水相中加入体积分数为0.2%的甲酸，改善了峰形并保证较高的离子化效率和质谱响应。广枣药材成分复杂，各类成分的极性相差较大，因此选择了大范围、长时间的梯度洗脱，使尽可能多的成分在色谱柱上实现较好分离。采用正、负离子两种模式下同时扫描样品，能最大程度地获取质谱信息。根据各个色谱峰在质谱中的精确相对分子质量、碎片信息、质谱裂解规律和色谱保留规律，并结合标准品的质谱信息和参考文献，最终鉴定出广枣药材果肉提取物中42个化学成分，其中占绝大多数的是有机酸类成分。在已鉴定的42个成分之中，首次在广枣中发现的成分有17个，包括奎宁酸、柠檬酸单甘油酯、诃子次酸、5-羟甲基糠醛、泛酸、comenic acid、原儿茶醛、二聚儿茶素、2-异丙基苹果酸、间羟基苯甲酸、6-羟基吲哚乳酸、没食子酸乙酯、东莨菪内酯、槲皮素-3-阿拉伯糖-7-葡萄糖苷、甲基鞣花酸-葡萄糖苷、二甲基鞣花酸-葡萄糖苷、甲基鞣花酸，这些化合物的结构确证还需进行LC/MS/SPE/NMR分析。从样品总离子流图可以看出，有一些响应较好的色谱峰其质量数未能在已有数据库中找到，表明广枣中还有一些未知成分，有待进一步研究开发。