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重组人源化XVII型胶原蛋白及其表达载体和基因工程菌的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-07-21 14:04

本发明属于基因工程领域，涉及一种重组人源化xvii型胶原蛋白及其表达载体和基因工程菌。

背景技术：

1、胶原蛋白是细胞外基质(ecm)中的主要结构蛋白，为皮肤、肌腱和软骨等结缔组织提供强度和弹性。在众多类型的胶原蛋白中，xvii型胶原蛋白(col17)因其在维持表皮基底角质形成细胞与下层真皮之间的粘附作用中发挥关键作用而备受关注。这种粘附对于皮肤及其附件的完整性至关重要，xvii型胶原蛋白的功能缺陷与一系列严重的皮肤水疱性疾病相关，如水疱性表皮松解症(eb)和水疱性天疱疮(bp)。

2、xvii型胶原蛋白是一种跨膜蛋白，包含胞外的三螺旋结构域和细胞膜锚定的胞内结构域，特别是胞外三螺旋结构域，为其在细胞-基质粘附中的功能提供了必要的结构稳定性。然而，尽管xvii型胶原蛋白具有重要的生物学功能，其重组蛋白的生产仍面临挑战，如包括难以实现高表达水平、正确的折叠以及功能活性。

3、传统的重组蛋白表达系统，如大肠杆菌原核表达体系，往往难以生产具有必要翻译后修饰、正确折叠和结构稳定性的类人胶原蛋白。因此，亟需改进的方法，以设计和生产能够准确模拟天然人源xvii型胶原蛋白的重组蛋白，确保其序列和生物学功能的准确性。

技术实现思路

1、本发明通过筛选人xvii型胶原蛋白中与细胞整合素结合的功能域，获得了4个具有高活性的功能片段，分别为f1、f2、f3和f4，通过对f2优化、将4个功能片段组合，或者进一步在组合片段的氨基端和羧基端分别融合gpp序列得到重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1703、jyc1702和jyc1701，经密码子优化后扩增克隆到ppic9k载体中，酶切线性化后转化到毕赤酵母细胞中，通过g418抗性梯度筛选高拷贝重组子，从而获得能表达重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702和jyc1703的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株。

2、本发明的技术方案如下：

3、四种功能片段，分别为f1、f2、f3和f4，其序列与人xvii型胶原蛋白具有100％一致性，且具有与细胞整合素结合的功能位点，其氨基酸序列分别如seq id no.1、seq idno.2、seq id no.3和seq id no.4所示。

4、重组人源化xvii型胶原蛋白，为jyc1701、jyc1702或jyc1703；所述jyc1703通过优化功能片段f2中的蛋白酶酶切位点和非gxy氨基酸残基后，将上述f1、优化后的f2、f3和f4四个功能片段按一定顺序组合而构成，其氨基酸序列如seq id no.5所示；所述jyc1701通过在jyc1703的氨基端和羧基端分别融合7个重复和6个重复的gpp序列而构成，其氨基酸序列如seq id no.6所示；所述jyc1702通过仅优化功能片段f2中的非gxy氨基酸残基后，将上述f1、优化后的f2、f3和f4四个功能片段按一定顺序组合得到携带有多个整合素结合活性位点的片段，并在组合片段的氨基端和羧基端分别融合7个重复和6个重复的gpp序列而构成，其氨基酸序列如seq id no.7所示。

5、编码上述重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的基因，其核苷酸序列如seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示。

6、一种重组表达载体，其为含有上述编码重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的基因的重组表达载体。在本发明具体实施方式中，以含有上述编码重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的基因的重组表达载体ppic9k-jyc1701、ppic9k-jyc1702或ppic9k-jyc1703为例。

7、上述重组表达载体的构建方法，具体步骤如下：

8、对seq id no.8、seq id no.9或seq id no.10所示的编码重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的基因序列进行高保真pcr扩增，将胶回收纯化后的目标片段通过无缝克隆到ppic9k空载体的α-mating因子分泌信号肽下游，经菌落pcr和测序验证正确后富集，获得重组表达载体ppic9k-jyc1701、ppic9k-jyc1702或ppic9k-jyc1703。

9、生产上述重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的毕赤酵母基因工程菌，其含有上述重组表达载体。在本发明具体实施方式中，以含有上述重组表达载体ppic9k-jyc1701、ppic9k-jyc1702或ppic9k-jyc1703为例。

10、上述毕赤酵母基因工程菌的构建方法，步骤如下：

11、将上述重组表达载体酶切线性化后转化到毕赤酵母gs115感受态细胞中，挑选阳性转化子，通过g418抗性梯度筛选高拷贝重组子，获得生产重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的毕赤酵母基因工程菌。

12、在本发明具体实施方式中，上述毕赤酵母基因工程菌的构建方法，步骤如下：

13、将上述重组表达载体ppic9k-jyc1701、ppic9k-jyc1702或ppic9k-jyc1703酶切线性化后转化到毕赤酵母gs115感受态细胞中，挑选阳性转化子，通过g418抗性梯度筛选高拷贝重组子，获得生产重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的毕赤酵母基因工程菌。

14、上述重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的制备方法，步骤如下：

15、将上述生产重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703的毕赤酵母基因工程菌接种到bmmy诱导培养基中，经甲醇诱导表达，对发酵上清液进行纯化，获得高纯度的重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702或jyc1703。

16、一种组合物，其包含上述重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702和jyc1703中的一种以上，所述的组合物包括但不限于护肤品、药物组合物等。

17、一种制品，其包含上述重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702和jyc1703中的一种以上，所述的制品包括但不局限于医疗器械、生物材料、组织工程产品等。

18、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

19、本发明通过筛选人xvii型胶原蛋白中与细胞整合素结合的功能域，获得4个具有高活性的功能片段(f1、f2、f3、f4)，对f2中的蛋白酶酶切位点和非gxy氨基酸残基优化后，将4个功能片段按一定顺序组合获得重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1703，或者对f2中的非gxy氨基酸残基优化后、或者蛋白酶酶切位点和非gxy氨基酸残基优化后将4个功能片段再按一定顺序组合并在氨基端和羧基端分别融合gpp序列，获得重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1702和jyc1701。本发明通过将重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702和jyc1703的编码基因序列根据毕赤酵母的密码子偏好性进行密码子优化，构建重组表达载体，并将其转入毕赤酵母菌株中，经g418抗性梯度筛选高拷贝重组子，获得能够生产重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702和jyc1703的高拷贝毕赤酵母基因工程菌，实现重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702和jyc1703的规模化生产。细胞实验发现，重组人源化xvii型胶原蛋白jyc1701、jyc1702和jyc1703均具有显著促进人成纤维细胞、表皮细胞和毛囊干细胞粘附、增殖和迁移的功效，可用于促进皮肤等组织的修复，提升皮肤的抵抗力，适用于制备护肤或者医疗器械等产品。