一种同步检测花毛茛中五种重要病毒病原的方法与流程

本发明属于植物病毒学技术领域，具体涉及一种同步检测花毛茛中重要病毒病原的方法。

背景技术：

花毛茛（ranunculusasiaticus）为毛茛科（ranunculaceae）毛茛属（ranunculuslinn）多年生草本花卉，又称芹菜花，波斯毛茛、草牡丹、赛牡丹。其花色丰富，其株形秀丽，花茎挺立；花朵硕大，花型似牡丹花，靓丽多姿；花瓣紧凑、多为重瓣或半重瓣，花色丰富、光洁艳丽。是春季盆栽观赏、布置露地花坛及花境、点缀草坪和用于鲜切花生产的理想花卉。其原产于欧洲东南部和亚洲西南部。1596年英国人引入进行人工栽培，在园林和切花中很常见。荷兰、英国、法国、美国、日本等栽培较多，并且培育出许多切花和盆栽品种。中国在上世纪90年代开始从荷兰、日本等引种，作为切花、盆栽和春季花卉展览用花在各大城市均有栽培和种植。

由于花毛茛品种多数由国外引种栽培，其生产种植过程中病虫害发生情况尚不清楚。初步调查发现在温室育苗过程中真、细菌和病毒病害以及蚜虫、蓟马等害虫均有发生，对于主要通过块茎和组培种苗进行扩繁种植的花卉品种，病毒病是花毛茛种苗生产中最为重要的病害。目前已发现包括马铃薯y病毒科、雀麦花叶病毒科5种病毒可侵染花毛茛。这些植物病毒病原侵染花毛茛植株后，植株会表现出典型的病毒病症状，包括叶片黄化、畸形，叶片增厚、植株矮化等，严重影响种苗质量及花色及形状。

通过化学药剂、高温及茎尖剥离脱毒技术可以脱除种苗中大部分病毒，该方法被用于马铃薯、果树、花卉等多种无性繁殖的农经作物。随着育苗企业和种植户对花毛茛种苗需求量增长，明确脱毒花毛茛种苗、田间植株以及环境中各种病原重要中间寄主的带毒情况，研究并应用一套准确、简便、灵敏、经济的检测方法用于种苗脱毒筛选和田间病原检测。根据前期对各地花毛茛田间植株、种苗及组培苗等样品的检测，以下5种病毒是目前为害最严重、发生区域较广泛、检出率最为普遍的病毒病原。

花毛茛轻花叶病毒（ranunculusmildmosaicvirus，rammv）、花毛茛叶片皱缩病毒（ranunculusleafdistortionvirus,raldv）和花毛茛花叶病毒（ranunculusmosaicvirus,ramv）均属于马铃薯ｙ病毒科（potyviridae）马铃薯y病毒属（potyvirus）成员。其病毒粒子为线状病毒，长度680～900nm，宽度12～15nm。病毒粒子为正单链rna分子，大约10kbp，编码一个多聚蛋白。该属病毒常引起花叶、皱缩、木质化，分布较广且造成严重经济损失。主要通过蚜虫非持久性非循环传播，此外病毒还可通过嫁接传播或刀具、剪刀类机械传播。

花毛茛隐症病毒（ranunculuslatentvirus，ralv）属于马铃薯ｙ病毒科（potyviridae）柘橙病毒属（macluravirus）成员。其病毒粒子为线状病毒，长度短于680nm，宽度12～15nm。主要通过蚜虫传播。花毛茛白斑驳病毒（ranunculuswhitemottlevirus,rawmv）蛇形病毒属（ophiovirus）成员。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种同步检测花毛茛中重要病毒病原的方法。

本发明的目的是这样实现的，所述的五种重要病毒病原为花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒和花毛茛叶片皱缩病毒，其特征在于，所述的同步检测花毛茛中五种重要病毒病原的方法包括以下步骤：

提取待测植物样本总rna或病毒rna；

设计用于扩增病毒病原花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒基因片段的特异性引物；

合成cdna第一链；

利用单管多重pcr扩增反应得到pcr扩增产物；

将获得的pcr扩增产物进行1.5-2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明用多引物复合反转录聚合酶链式反应（rt-pcr）结合，通过提取植物总rna、随机引物合成不同种类病毒cdna第一链、5种病毒特异引物多重复合pcr检测，省略了单一病毒引物逆转录合成cdna第一链和病毒核苷酸序列测定与分析等步骤，利用多重pcr的快速和灵敏性获得目的片段，为大量、快速、准确、灵敏检测各类花毛茛病样建立了一种科学的方法。

本发明的技术方案如下：

（1）应用trizol试剂提取待测样品总rna；

（2）高温变性获得病毒rna作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cdna链；

（3）利用花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒5种病毒特异引物对进行多重复合pcr反应；

（4）琼脂糖凝胶电泳检测。

具体操作如下：

（1）综合比较分析了花毛茛中重要病毒病原花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒5种病毒基因组保守序列，应用genbank中primer-blast程序以及primerpremier生物软件相互印证进行特异引物设计；

（2）取新鲜或低温保存待测样品50-150mg，应用trizol试剂1-1.5ml，提取植物总rna，溶解于20-30μldepc处理的灭菌水中，-80℃中保存备用；

（3）在无rna酶的pcr管中加入提取的西番莲植物总rna样品1-3μg高温变性获得病毒rna作为模板，利用6个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cdna第一链；

（4）在单管pcr中加入5种病毒上下游引物进行多重pcr扩增5种病毒特异片段;

（5）将获得的pcr扩增产物进行1.5-2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

结果分析：随机引物逆转录反应合成cdna第一链，4种病毒特异性引物组合扩增样品中不同种类病毒，产物经琼脂糖电泳，根据片段大小：花毛茛轻花叶病毒阳性样品中可扩增出大小约580bp的目的片段；花毛茛隐症病毒阳性样品中可扩增出大小720bp的目的片段；花毛茛白斑驳病毒阳性样品中可扩增出大小约677bp的目的片段；花毛茛花叶病毒阳性样品中可扩增出大小374bp的目的片段；花毛茛叶片皱缩病毒阳性样品中可扩增出大小约430bp的目的片段。根据不同样品中目的片段的有无、大小差异，快速、特异的确定西番莲样品中待测4种病毒种类及数量。

本发明的方法应用多重复合rt-pcr，从而快速、特异的检测花毛茛样品中的花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒。

本发明的优点：应用花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒5种病毒特异引物可以同时在单pcr管中检测5种花毛茛主要病毒，特异性、简便性、灵敏度和准确性较单一病毒或两种病毒检测有较大的优势。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的五种重要病毒病原为花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒和花毛茛叶片皱缩病毒，其特征在于，所述的同步检测花毛茛中五种重要病毒病原的方法包括以下步骤：

提取待测样本中植物总rna或病毒rna；

设计用于扩增病毒病原花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒基因片段的特异性引物；

合成cdna第一链；

利用单管多重pcr扩增反应得到pcr扩增产物；

将获得的pcr扩增产物进行1.5-2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

所述的特异性引物为：

花毛茛轻花叶病毒特异引物：

rammv-1055f：5′-gatggaaggcgaagaaca-3′；

rammv-1634r：5′-agcggtcattatacgattca-3′；

花毛茛隐症病毒特异引物：

ralv-645f：5′-aatcgttggcatacacattc-3′；

ralv-1364r：5′-cacagttccttcttcttcatc-3′；

花毛茛白斑驳病毒特异引物：

rawhmv-2876f：5′-aagacataaggcagtgaagt-3′；

rawhmv-3552r：5′-aaggcagcaggaggtaat-3′；

花毛茛花叶病毒特异引物：

ramv-554f：5′-agataagcagcaacctaagt-3′；

ramv-927r：5′-ccatcagtccaccaagtag-3′；

花毛茛叶片皱缩病毒特异引物：

raldv-1090f：5′-agaacactggcaagatacg-3′；

raldv-1519r：5′-ccttcctggtgagatggt-3′。

所述的管多重pcr扩增反应的反应体系为：50μl，10倍taq酶缓冲液5μl、10mmol/l浓度的4对种引物各1μl、2.5mmol/ldntps3μl、cdna5μl、taq酶1μl、灭菌超纯水28μl。

所述的管多重pcr扩增反应的反应条件为：94℃预变性3-5min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30-40个循环；最后72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳检测是应用0.5倍tbe缓冲液配置1.5-2.0%琼脂糖凝胶，取5μlpcr反应液，加1μl6倍上样缓冲液，混合均匀后点样。电泳参数为电压6v/cm、电泳时间约为60-80min。溴化乙锭或花青素染色15min，紫外成像仪中观察、记录。

下面以具体实施例对本发明作进一步说明：

1.引物设计：

根据genbank中花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒5种病毒部分基因组核苷酸序列，选择病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的内部配对、聚合等影响，经ncbi中的blast-primer检测筛选可用于复合pcr的不同病毒检测引物对（附表1）。

2.随机引物逆转录合成cdna链

随机引物逆转录反应体系20μl，高温变性获得病毒rna模板时，加4μl5倍逆转录缓冲液和9μldepc处理水至上述处理的pcr管中，手指轻弹2-3min后短暂离心，加入10mmol/l6个单核苷酸碱基随机引物（引物序列为：5′-(p)nnnnnn-3′）2μl,充分混匀后短暂离心，65℃中放置5min，即刻将pcr管插入冰内放置5min，依次加入10mmol/ldntps4μl、鼠源逆转录酶0.5μl、rna酶抑制剂0.5μl，30℃反应10min后40℃反应50min，反应完成后pcr管（含20μl反应液）4℃保存待用。

3.多重复合pcr检测。

在上述pcr管内（含20μl反应液）应用花毛茛轻花叶病毒、花毛茛隐症病毒、花毛茛白斑驳病毒、花毛茛花叶病毒、花毛茛叶片皱缩病毒5种病毒特异引物对进行复合pcr反应，pcr反应体系为50μl，其中10倍taq酶缓冲液5μl、10mmol/l浓度的5种引物（详见表1）各1μl、2.5mmol/ldntps3μl、taq酶1μl、灭菌超纯水15μl。反应条件为94℃预变性4min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。

4.琼脂糖凝胶电泳

取5μlpcr反应液，加1μl6倍上样缓冲液，混合均匀后点样。电泳参数为电压20v/cm、电泳时间约为60-80min。染色15min，清水漂洗后紫外成像仪中观察、记录。

5.判定标准

花毛茛轻花叶病毒阳性样品中可扩增出大小约580bp的目的片段；花毛茛隐症病毒阳性样品中可扩增出大小720bp的目的片段；花毛茛白斑驳病毒阳性样品中可扩增出大小约677bp的目的片段；花毛茛花叶病毒阳性样品中可扩增出大小374bp的目的片段；花毛茛叶片皱缩病毒阳性样品中可扩增出大小约430bp的目的片段。根据样品中目的片段的有无、大小差异，快速、特异的确定烟草样品中待测5种病毒种类及数量。

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<110>云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

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