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客户文章|17+药用植物长春花叶片单细胞图谱绘制

来源：花匠小妙招时间：2025-05-14 22:21

随着悬液制备经验的不断完善，基迪奥合作客户发表单细胞技术文章涉及的物种也是越来越多，除了水产经济动物屡屡发文外，现如今药用植物也是迎来了单细胞级别的转录组图谱研究文章！

就在此月，中国医学科学院药用植物研究所联合中国中医科学院中药研究所、成都中医药大学和法国图尔大学在期刊 Nature Plants 上发表题为“Single-cell RNA sequencing provides a high-resolution roadmap for understanding the multicellular compartmentation of specialized metabolism”的研究论文。

该研究成功通过第三代全长DNA测序与单细胞转录组测序联合分析，获得首个重要药用植物单细胞转录组图谱，揭示了长春碱生物合成途径在长春花叶片中的分布情况，在不同细胞类型中发挥不同生物学功能。此外，作者还发现多个细胞特异性的转运蛋白可能参与了单萜吲哚生物碱在细胞间/内的跨膜转运过程，而单萜吲哚生物碱转运蛋白可能作为分子育种和转运蛋白合成生物学研究的潜在靶点，为研究植物药和中药有效成分的生物合成、转运等机制开辟了新途径。

本研究将药用植物有效成分生物合成研究从组织器官深入到单细胞水平，从而挖掘药用植物有效成分发挥作用的关键机制与潜在靶点。

实验背景

长春花（Catharanthus roseus (L.) G. Don）为龙胆目夹竹桃科半灌木或多年生草本植物，原产于非洲马达加斯加岛，是世界各地广泛栽培的一种花卉植物。长春花能够合成130多种单帖吲哚生物碱（MIA），其中包括抗癌药物长春碱和长春新碱以及降压药物阿吗碱和蛇根碱等。因此，长春花被认为是研究MIA生物合成的模式植物。

实验设计

从幼嫩的长春花叶片制备高质量的原生质体上机建库测序。三个生物学重复。

实验结果

长春花原生质体细胞图谱

通过长读测序（Long-Read Sequencing，LRS），即第三代DNA测序，作者获得了长春花基因组图谱，并以此作为单细胞转录组的参考基因组。

图1 长春花基因组特征

将65000个原生质体上机建库测序得到单细胞转录组测序数据，通过标记基因对亚群进行注释，鉴定得到7种细胞类型：增殖细胞（proliferating cell，PC）、叶肉细胞（mesophyll cell，MC）、内部韧皮部相关薄壁细胞（internal phloem-associated parenchyma cell， IPAP）、异形细胞（idioblast cell，IC）、维管束细胞（vascular cell，VC）、表皮细胞（epidermal cell，EC）和气孔细胞（guard cell，GC），其中表皮EC细胞可进一步鉴定为未成熟的表皮细胞（EC1）以及成熟的表皮细胞（EC2）。上述鉴定结果通过RNA原位杂交技术得到验证。

图2 长春花原生质体细胞图谱注释与验证

此外，研究人员还比较了长春花叶片和拟南芥叶片的单细胞转录组数据集，不仅验证了长春花细胞分群和注释的准确性，也证实了双子叶植物叶片进化的保守性。其中，跨物种细胞亚群聚类相关性分析显示长春花的未知细胞类型UN与拟南芥MC具有较高的相关性，表明在长春花叶片中未能鉴定出细胞类型的UN可能是一种叶肉细胞。

图3 长春花和拟南芥细胞图谱比对

MIA生物合成过程中的转运机制

为了研究不同细胞类型MIA途径的功能活性，作者对MIA途径相关基因的表达量进行气泡图可视化。结果发现甲基赤藓糖醇（MEP）途径和环烯醚萜（Iridoid）途径相关基因高度富集，说明MIA骨架中的萜类部分可能是主要通过MEP途径在IPAP中合成的；

而大多数甲羟戊酸（MVA）途径的相关酶基因主要在EC中表达，说明MIA合成途径的中间部分主要在EC中合成，包括从马钱苷酸甲基转移酶到长春质碱合酶和水甘草碱合酶的10余个酶，以及色氨酸脱氢酶。

其他MIA分支途径的酶基因多在IC中高表达，提示途径的最后两步在IC中完成。

图4 长春碱生物合成过程

此外，如图4b所示，在长春碱生物合成过程中，不同细胞类型之间的中间转运至少发生了三次，因此，鉴定MIA转运中间体的细胞特异性候选体是更好地理解MIA转运机制及其在通路分隔中作用的一个重要入手点。作者认为有四种转运体家族可能参与了植物生物碱的转运：ABC（ATP-binding cassette transporter）、NPF（Nitrate/Peptide family）、MATE（Multidrug And Toxic Compound Extrusion Family,）和PUP( Purine permease family），其中有15个转运蛋白在参与MIA生物合成的IPAP、EC和IC细胞中表达。

通过细胞特异性表达分析和系统发育分析发现2个ABC、2个MATE和4个PUP可能参与了MIA中间产物的转运，其中CrMATE1、CrABCG8、CrNPF2.9和CrTPT2等主要与EC转运相关；多个PUP家族蛋白和CrMATE16等主要与IC转运相关；而在这些候选转运体中并没有发现IPAP特异性转运体。

拟时分化发育研究

在细胞类型鉴定时，EC被鉴定为未成熟EC1与成熟EC2两种不同的亚型，并且在上述研究中可发现其在MIA生成中起到至关重要的作用，因此作者对EC进行亚群再分群并通过拟时分析构建了细胞分化发育轨迹。发育轨迹从EC_2开始，其次是EC_3、EC_4和EC_1，而EC_0细胞则根据AMTL1和CER3的表达模式分布在轨迹的末端。

注释结果表明，在发育轨迹起始阶段富集的基因主要参与分生组织生长调节和细胞生长过程，符合早期发育EC的生理状态，而在轨迹末端功能富集的基因主要参与蛋白质磷酸化和非生物应激反应，这与成熟表皮细胞响应环境刺激的高敏感性相一致。此外，大多数在EC中特异表达的MIA基因在EC发育的早期细胞中表达水平较高，沿轨迹表达量持续下降，其中TDC、CS、16OMT和T3O的表达大幅下降，在轨迹末端（成熟的EC）很少表达，只有PRX在EC发育后期表达水平略高。这一现象表明，在EC特异表达的MIA基因的活性受到EC发育的紧密调控。

图5 表皮细胞拟时分化分析

作为植物生物碱运输和生物合成至关重要的维管束细胞，作者也同样对其进行了拟时分析研究。通过亚群再分群将VC划分为6个亚群，其中8_1亚群被注释为原形成层细胞，而8_2和8_5被注释为伴胞（companion cell, CC）。基于3个亚群构建了从原形成层到CC连续分化的拟时轨迹。GO富集分析结果显示，位于轨迹起点的基因注释结果与原形成层相关生理功能的细胞增殖和核小体组装等过程相一致，而糖摄取、离子运输以及能量需求等过程的注释基因均在轨迹末端富集，与CC的生理功能相一致。

图6 维管束细胞拟时分化分析

小结

本研究通过第三代全长DNA测序作为参考基因组成功地构建了单细胞级别的长春花叶片细胞图谱；同时，本文也通过拟南芥单细胞图谱数据有效验证了长春花叶片图谱注释的可靠性。对于研究药用植物有效成分的作用机制提供了有效思路并得到了一定的研究成果，对于后续学者研究药用植物单细胞图谱来说无疑是奠定性的一步。

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