首页分享小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法.pdf

小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-05-14 22:20

《小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法.pdf（8页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102367460 A (43)申请公布日 2012.03.07 CN 102367460 A *CN102367460A* (21)申请号 201110214583.4 (22)申请日 2011.07.29 C12P 17/18(2006.01) C12N 5/04(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人无锡维开敏生物科技有限公司地址 214092 江苏省无锡市滨湖区马山梅梁西路 88 号 (72)发明人倪迪安倪新忠 (74)专利代理机构上海浦东良风专利代理有限责任公司 31113 代理人潘志龙 (54) 发明名称小。

2、蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法 (57) 摘要本发明为一种小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法。本发明以野生小蔓长春花叶片为原始材料诱导出愈伤组织，经过多代定向诱导驯化，建立了适合大规模培养细胞培养系统，该培养物和小蔓长春花叶片中长春胺含量相当。本发明的优点是： ( 一 ) 生产过程完全可控，不受自然环境的影响； (二)无农药及重金属残留； (三)提取工艺简单； ( 四 ) 低成本，节约大量耕地。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 6 页 CN 102367468 A1。

3、/1 页 2 1. 一种小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法，其特征在于：包括如下步骤： 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基：取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0010.002 克萘乙酸和 67 克琼脂粉为单位，得固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0010.002 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用； 2）小蔓长春花细胞系的制备：以长春花叶片为外植体，将其用浓度为 70%75% 医用乙醇浸泡 30 秒，随后转移至浓度为 10%12% 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中。

4、，在温度为 25+1下，经 4 周 5 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在所述固体生长培养基中培养，培养温度为 25+1， 3 周 4 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所述松软愈伤组织继续继代培养 810 代，得细胞系； 3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系作为种源，接种于液体生长培养基中扩增，培养条件为温度25+1、暗培养、摇床转速150170转/分钟或螺旋叶轮转速100转/分钟、培养 8天10天，得种子细胞；将所得种子细胞在所述液体生长培养基中接种，接种量为615%W/ V，继续培养 7。

5、天 12 天，培养条件为温度 25+1、暗培养、摇床转速 150 转 / 分钟 170 转 / 分钟或螺旋叶轮转速 100 转 / 分钟；随后从所得培养液中提取获得生物碱长春胺。 2. 根据权利要求 1 所述的小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法，其特征在于：将步骤 1 中所述固体生长培养基、液体生长培养基分别经高压灭菌后，调节 pH 值至 5.75.8。 3.根据权利要求1或2 所述的小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法，其特征在于：将步骤 1 中所述固体基本培养基、液体生长培养基分别经高压灭菌后，用 HCl 或 NaOH 或两者结合调节固体生长培。

6、养基、液体生长培养基的 pH 值至 5.75.8。 4. 根据权利要求 1 所述的小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法，其特征在于：将步骤 1 中所述固体生长培养基、液体生长培养基分别分装于反应器中备用。 5. 根据权利要求 4 所述的小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法，其特征在于：所述反应器的容积为 0.2 升 1000 升，所述反应器中固体生长培养基、液体生长培养基的体积分别占反应器容积的 25%80%。权利要求书 CN 102367460 A CN 102367468 A1/6 页 3 小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法技术领域 00。

7、01 本发明属生物工程技术领域，涉及一种小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法。背景技术 0002 小蔓长春花(Vinca minor Linn.) 夹竹桃科多年生草本。以全草入药。分布于欧洲东南部、中部和中亚地区。1978 年从南斯拉夫引进，先后在北京、浙江温州及山东潍坊等地引种成功。对脑血管引起的各种症状如偏瘫、失语症、老年性脑退化等都有治疗作用。 0003 长春胺是由夹竹桃科植物小蔓性长春花中提得的一种生物碱，为一种脑血管扩张剂，适用于脑血管障碍、脑栓塞、脑血栓形成及出血后遗症等。对脑动脉硬化症的疗效比氢麦角碱和罂粟碱强。 0004 长春西汀为脑血管。

8、扩张药，对大脑血管有选择性作用，能改善大脑氧的供给。并有改善记忆力、视力和老年听力等作用。 0005 然而目前我国长春胺原料全部依赖进口、并已持续多年，一旦国内解决了提取长春胺的植物来源问题，长春胺产品市场将迎来高速增长。如果能够使长春胺的生产摆脱对农业生产的依赖，避免从天然小蔓长春花中提取这一过程的局限，同时又保持其产品的天然产物特性，占用相比于大田种植极小的土地及空间，实现对该类生物碱集约型的工厂化生物生产，对促进该类生物碱在医药、保健等领域的开发与应用，将会具有重大的现实意义。发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，利用植。

9、物细胞的大规模培养技术，提供一种小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法。 0007 本发明是这样实现的：一种小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法，其特征在于：包括如下步骤： 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基：取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0010.002 克萘乙酸和 67 克琼脂粉为单位，得固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0010.002 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用； 2）小蔓长春花细胞系的制备：以长春花叶片为外植体，将其用浓度为 70%75% 医用乙醇浸泡 30 秒，随后转移至浓。

10、度为 10%12% 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为 25+1下，经 4 周 5 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在所述固体生长培养基中培养，培养温度为 25+1， 3 周 4 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所述松软愈伤组织继续继代培养 810 代，得细胞系； 3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系作为种源，接种于液体生长培养基中扩增，培养条件为温度25+1、暗培养、摇床转速150170转/分钟或螺旋叶轮转速100转/分钟、培养说明书 CN 。

11、102367460 A CN 102367468 A2/6 页 4 8天10天，得种子细胞；将所得种子细胞在所述液体生长培养基中接种，接种量为615%W/ V，继续培养 7 天 12 天，培养条件为温度 25+1、暗培养、摇床转速 150 转 / 分钟 170 转 / 分钟或螺旋叶轮转速 100 转 / 分钟；随后从所得培养液中提取获得生物碱长春胺。 0008 将步骤 1 中所述固体生长培养基、液体生长培养基分别经高压灭菌后，调节 pH 值至 5.75.8。 0009 将步骤 1 中所述固体基本培养基、液体生长培养基分别经高压灭菌后，用 HCl 或 NaOH 或两。

12、者结合调节固体生长培养基、液体生长培养基的 pH 值至 5.75.8。 0010 将步骤 1 中所述固体生长培养基、液体生长培养基分别分装于反应器中备用。 0011 所述反应器的容积为0.2升1000升，所述反应器中固体生长培养基、液体生长培养基的体积分别占反应器容积的 25%80%。 0012 本发明的有益效果是： (一)生产过程完全可控，不受自然环境的影响； (二)无农药及重金属残留； (三)提取工艺简单； (四)低成本，节约大量耕地。本发明以小蔓长春花叶片为原始材料，对外植体进行诱导培养，建立并筛选出了适合通过二步细胞培养法生产长春胺，并建立了悬浮培养。

13、系。该方法有培养周期短、产率高、对环境无污染等特点。小蔓长春花通过反应器生产长春胺现在没有先例，通过本发明方法实现了将小蔓长春花通过反应器生产长春胺，解决了我国长春胺原料全部依赖进口的现状。具体实施方式 0013 本发明一种小蔓长春花细胞大规模培养生成长春胺的方法，包括如下步骤： 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基：取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0010.002 克萘乙酸和 6 7 克琼脂粉为单位，得固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0010.002 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用； 2）小蔓长春花细胞系。

14、的制备：以长春花叶片为外植体，将其用浓度为 70%75% 医用乙醇浸泡 30 秒，随后转移至浓度为 10%12% 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为 25+1下，经 4 周 5 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在所述固体生长培养基中培养，培养温度为 25+1， 3 周 4 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所述松软愈伤组织继续继代培养 810 代，得细胞系； 3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系作为种源，接种于液体生长培养基中扩增，培养条件为温度2。

15、5+1、暗培养、摇床转速150170转/分钟或螺旋叶轮转速100转/分钟、培养 8天10天，得种子细胞；将所得种子细胞在所述液体生长培养基中接种，接种量为615%W/ V，继续培养 7 天 12 天，培养条件为温度 25+1、暗培养、摇床转速 150 转 / 分钟 170 转 / 分钟或螺旋叶轮转速 100 转 / 分钟；随后从所得培养液中提取获得生物碱长春胺。 0014 将步骤 1 中所述固体生长培养基、液体生长培养基分别经高压灭菌后，调节 pH 值至 5.75.8。 0015 将步骤 1 中所述固体基本培养基、液体生长培养基分别经高压灭菌后，用 HCl 。

16、或 NaOH 或两者结合调节固体生长培养基、液体生长培养基的 pH 值至 5.75.8。 0016 将步骤 1 中所述固体生长培养基、液体生长培养基分别分装于反应器中备用。 0017 所述反应器的容积为0.2升1000升，所述反应器中固体生长培养基、液体生长培说明书 CN 102367460 A CN 102367468 A3/6 页 5 养基的体积分别占反应器容积的 25%80%。 0018 下面就具体实施例对本发明作进一步阐述。 0019 实施例一：本实施例包括如下步骤。 0020 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基：取 MS 基本培养基，以每升加入 0。

17、.001 克萘乙酸和 6 克琼脂粉为单位，得固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.001 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用。 0021 生长培养基调 pH 值：用 pH 计测定固体生长培养基、液体生长培养基 pH 值，并用 HCl 和 NaOH 分别调节固体生长培养基和液体生长培养基的 pH 值到 5.8。然后以三角瓶作为反应器，将固体生长培养基、液体生长培养基分别分装于容积为 0.2 升的三角瓶中，每瓶装 0.05 升生长培养基，即生长培养基的体积占反应器容积的 25%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为 1.0 1.2K。

18、g/cm2，时间为 20 分钟，备用。以下不同步骤中所提到的生长培养基，分别取自上述步骤 1 中分装于三角瓶的生长培养基。 0022 2）小蔓长春花细胞系的制备：以长春花叶片为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为10% 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为 25下，经 4 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在固体生长培养基中培养，培养温度为 25， 3 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所得松软愈伤组织继续继代培养 8 代，得细胞系；。

19、3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系作为种源，在超净工作台中接种于上述步骤 1 中的液体生长培养基中扩增，培养条件为温度 25、暗培养、摇床转速 150 转 / 分钟、培养 9 天，得种子细胞；将所得种子细胞在液体生长培养基中接种，接种量 ( 以细胞鲜重计 ) 为 6%W/V，继续培养 7 天，培养条件为温度 25、暗培养、摇床转速 150 转 / 分钟；随后从所得培养液中提取获得生物碱长春胺。 0023 实施例二：本实施例包括如下步骤。 0024 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基：取 MS 基本培养基，以每升加入 0.002 。

20、克萘乙酸和 7 克琼脂粉为单位，得固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.002 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用。 0025 生长培养基调 pH 值：用 pH 计测定固体生长培养基、液体生长培养基 pH 值，并用 HCl 调节生长培养基 pH 值到 5.8。然后以三角瓶作为反应器，将固体生长培养基、液体生长培养基分别分装于容积为0.5升的三角瓶中，每瓶装0.2升，即生长培养基的体积占反应器容积的 40%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为 1.0 1.2Kg/cm2，时间为 20 分钟，备用。以下不同步骤中所提到的生长培养。

21、基，分别取自上述步骤 1 中分装于三角瓶的生长培养基。 0026 2）小蔓长春花细胞系的制备：以小蔓长春花叶片为外植体，将其用浓度为 75% 医用乙醇浸泡 30 秒，随后转移至浓度说明书 CN 102367460 A CN 102367468 A4/6 页 6 为 11 % 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为 24下，经 4 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在固体生长培养基中培养，培养温度为 24， 4 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所得松软愈伤组织继续继。

22、代培养 10 代，得细胞系； 3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系作为种源，在超净工作台中接种于上述步骤 1 中的液体生长培养基中扩增，培养条件为温度 24、暗培养、摇床转速 160 转 / 分钟、培养 8 天，得种子细胞；将所得种子细胞在液体生长培养基中接种，接种量 ( 以细胞鲜重计 ) 为 10%W/V，继续培养 7 天，培养条件为温度 24、暗培养、摇床转速 170 转 / 分钟；随后从所得培养液中提取获得生物碱长春胺。 0027 实施例三：本实施例包括如下步骤。 0028 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基：取 MS 基。

23、本培养基，以每升加入 0.0015 克萘乙酸和 6 克琼脂粉为单位，得固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0015 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用。 0029 生长培养基调 pH 值：用 pH 计测定固体生长培养基、液体生长培养基 pH 值，并用 NaOH 调节生长培养基 pH 值到 5.7。然后以三角瓶作为反应器，将固体生长培养基、液体生长培养基分别分装于容积为3升的三角瓶中，每瓶装0.8升，即生长培养基的体积占反应器容积的26.7%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为1.01.2Kg/cm2，时间为20分钟，备用。

24、。以下不同步骤中所提到的生长培养基，分别取自上述准备工作中分装于三角瓶的生长培养基。 0030 2）小蔓长春花细胞系的制备：以长春花叶片为外植体，将其用浓度为73%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为12% 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为 26下，经 5 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在固体生长培养基培养，培养温度为 26， 4 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所得松软愈伤组织继续继代培养 9 代，得细胞系； 3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系。

25、作为种源，在超净工作台中接种于上述步骤 1 中的液体生长培养基中扩增，培养条件为温度 26、暗培养、摇床转速 170 转 / 分钟、培养 10 天，得种子细胞；将所得种子细胞在液体生长培养基中接种，接种量 ( 以细胞鲜重计 ) 为 8%W/V，继续培养 10 天，培养条件为温度 26、暗培养、摇床转速 150 转 / 分钟；随后从所得培养液中提取获得生物碱长春胺。 0031 本发明最终大规模培养反应器的培养灌超过 10 升时，必须具备补料灌（大规模培养反应器包括培养灌和补料灌），补料灌为反应器总容量的 25%80%，连续放大培养需按照 45 倍体积递。

26、增，即 10 升 -50 升 -250 升 -1000 升（10 升 -50 升，为 5 倍； 50 升 -250 升，为 5 倍； 250 升 -1000 升，为 4 倍）。在培养的最终一级如 1000 升，要配备 800 升的补料灌以备说明书 CN 102367460 A CN 102367468 A5/6 页 7 加入生产培养基之需。生产培养一般只在最终培养的一级进行。 0032 实施例四：本实施例包括如下步骤。 0033 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基：取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0015 克萘乙酸和 6 克琼脂粉为单位，得。

27、固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.0015 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用。 0034 生长培养基调 pH 值：用 pH 计测定固体生长培养基、液体生长培养基 pH 值，并用 NaOH 调节生长培养基 pH 值到 5.7。分别将 5L 生长培养基置于 10L 规格培养罐和 8L 规格补料灌中灭菌，灭菌结束后，调节罐体即培养灌及补料灌的出气阀，以保证罐及管路中的气体正压。 0035 2）小蔓长春花细胞系的制备：以长春花叶片为外植体，将其用浓度为73%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为12% 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；。

28、将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为 26下，经 5 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在固体生长培养基培养，培养温度为 26， 4 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所得松软愈伤组织继续继代培养 9 代，得细胞系； 3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系作为种源，在上述步骤 1 中的液体生长培养基中扩增，得种子细胞，将所得种子细胞在液体生长培养基中接种，接种量为 15 W/V，进行培养，温度 26，通气速率 05vvm，搅拌速度 ( 螺旋叶轮 )100 转分钟，黑暗，培养 12 天。

29、，当 PCV 达到 75以上，细胞生长达到指数末期时取样，提取生物碱。 0036 实施例五：本实施例包括如下步骤。 0037 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基：取 MS 基本培养基，以每升加入 0.002 克萘乙酸和 7 克琼脂粉为单位，得固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.002 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用。 0038 生长培养基调 pH 值：用 pH 计测定固体生长培养基、液体生长培养基 pH 值，并用 NaOH 和 HCl 调节生长培养基 pH 值到 5.8。分别将 300L 生长培养基置于 500L 规。

30、格培养罐和 200L 培养基置于 300L 规格补料灌中灭菌，灭菌结束后，调节罐体（即培养灌及补料灌）出气阀，以保证罐及管路中的气体正压。 0039 2）小蔓长春花细胞系的制备：以长春花叶片为外植体，将其用浓度为75%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为11% 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为 24下，经 4.5 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在固体生长培养基培养，培养温度为 24， 3.5 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所得松软愈伤组织继续继代培。

31、养 10 代，得细胞系；说明书 CN 102367460 A CN 102367468 A6/6 页 8 3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系作为种源，在上述步骤 1 中的液体生长培养基中扩增，得种子细胞，将所得种子细胞在液体生长培养基中接种，接种量为 14 W/V，进行培养，温度 24，通气速率 05vvm，搅拌速度 ( 螺旋叶轮 )100 转分钟，黑暗，培养 11 天，当 PCV 达到 75以上，细胞生长达到指数末期时取样，提取生物碱。 0040 实施例六：本实施例包括如下步骤。 0041 1）分别制备固体生长培养基、液体生长培养基。

32、：取 MS 基本培养基，以每升加入 0.002 克萘乙酸和 7 克琼脂粉为单位，得固体生长培养基备用；另取 MS 基本培养基，以每升加入 0.002 克萘乙酸为单位，得液体生长培养基备用。 0042 生长培养基调 pH 值：用 pH 计测定固体生长培养基、液体生长培养基 pH 值，并用 HCl 调节生长培养基 pH 值到 5.8。分别将 550L 生长培养基置于 1000L 规格培养罐和 450L 培养基置于500L规格补料灌中灭菌，灭菌结束后，调节罐体（即培养灌及补料灌）出气阀，以保证罐及管路中的气体正压。 0043 2）小蔓长春花细胞系的制备：以。

33、长春花叶片为外植体，将其用浓度为74%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为12% 的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为 26下，经 4 周暗培养后，外植体的切口处形成愈伤组织；将得到的愈伤组织继续在固体生长培养基培养，培养温度为 26， 4 周继代一次，培养 10 代后，得松软愈伤组织；将所得松软愈伤组织继续继代培养 8 代，得细胞系； 3）长春胺的制备：将步骤 2 所得细胞系作为种源，在上述步骤 1 中的液体生长培养基中扩增，得种子细胞，将所得种子细胞在液体生长培养基中接种，接种量为 13 W/V，进行培养，温度 24，通气速率 05vvm，搅拌速度 ( 螺旋叶轮 )100 转分钟，黑暗，培养 10 天，当 PCV 达到 75以上，细胞生长达到指数末期时取样，提取生物碱。说明书 CN 102367460 A 。