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一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsRNA、引物对及其应用的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-05-10 15:42

一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsRNA、引物对及其应用的制作方法
一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsrna、引物对及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsrna、引物对及其应用。

背景技术：

2.松材线虫bursaphelenchus xylophilus在全球及我国的森林资源造成了严重破坏了许多国家的松林(nickle,w.r.(1970).a taxonomic review of the genera of the aphelenchoidea(fuchs,1937)thorne,1949(nematoda:tylenchida).journal of nematology 2(4),375-392.)，松材线虫的传播与其昆虫媒介密切相关(张建军,张润志,陈京元.松材线虫媒介昆虫种类及其扩散能力[j].浙江林学院学报,2007,24(3):350-6.)。云杉花墨天牛monochamus saltuarius(鞘翅目：天牛科)是中国东北部一种新记录的媒介，是松材线虫传入北方地区的最重要媒介昆虫，对我国东北地区的松林造成严重威胁。
[0003]
rna干扰(rnai)是一种高度保守的细胞机制，通过内源性或外源性小rna诱导rna降解(neumeier,j.,and meister,g.(2021).sirna specificity:rnai mechanisms and strategies to reduce off-target effects.frontiers in plant science 11,526455.)。rna干扰技术具有高度特异性，对作物、人类和动物无害，具有很大的应用潜力。该技术已成为开发新的森林害虫管理方法的重要选择。
[0004]
靶基因筛选是将rnai用作害虫防治技术的先决条件(rodrigues,t.b.,rieske,l.k.,j duan,j.,mogilicherla,k.,and palli,s.r.(2017).development of rnai method for screening candidate genes to control emerald ash borer,agrilus planipennis.scientific reports 7(1),7379-7379.doi:10.1038/s41598-017-07605-x.)。云杉花墨天牛生命周期的大部分阶段生活在寄主树木的韧皮部和形成层区域，这种隐藏的生活史使其种群比许多农业害虫更难控制。因此，云杉花墨天牛的成体阶段是唯一一个在寄主外的自由阶段，对其控制至关重要。化学感觉系统，特别是嗅觉系统在云杉花墨天牛成虫阶段的取食、交配和产卵过程中起着重要作用。因此，嗅觉识别相关基因是云杉花墨天牛成虫阶段rna干扰的良好候选靶基因，但是云杉花墨天牛嗅觉蛋白相关的研究还较少。有必要在云杉花墨天牛中开展基于嗅觉及嗅觉蛋白的研究，并用于其防治。

技术实现要素：

[0005]
为了解决上述问题，本发明提供了一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsrna、引物对及其应用。本发明提供的dsrna可以高效的沉默云杉花墨天牛的嗅觉基因，能够导致云杉花墨天牛嗅觉识别能力下降，影响成虫交配，最终达到防治的效果。
[0006]
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007]
本发明提供了一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsrna，所述dsrna包括dscsp3、dscsp5、dsobp14、dsobp28、dsor1和dssnmp1中的一种或多种；所述dscsp3的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述dscsp5的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.2所
示；所述dsobp14的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述dsobp28的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述dsor1的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述dssnmp1的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0008]
本发明还提供了一种扩增上述方案所述dsrna的引物组，所述引物组包括引物对1～6中的一种或多种；引物对1的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示；引物对1的下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；引物对2的上游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示；引物对2的下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；引物对3的上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示；引物对3的下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示；引物对4的上游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示；引物对4的下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；引物对5的上游引物的核苷酸序列如seq id no.15所示；引物对5的下游引物的核苷酸序列如seq id no.16所示；引物对6的上游引物的核苷酸序列如seq id no.17所示；引物对6的下游引物的核苷酸序列如seq id no.18所示。
[0009]
本发明还提供了上述方案所述dsrna的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
以云杉花墨天牛的cdna为模板，利用上述方案所述的引物组进行pcr扩增，得到pcr产物；以所述pcr产物为模板，采用dsrna合成试剂盒制备得到所述dsrna。
[0011]
本发明还提供了上述方案所述的dsrna或上述方案所述的引物组或利用上述方案所述制备方法得到的dsrna在防治云杉花墨天牛中的应用。
[0012]
本发明还提供了上述方案所述的dsrna或上述方案所述的引物组或利用上述方案所述制备方法得到的dsrna在制备防治云杉花墨天牛的产品中的应用。
[0013]
本发明还提供了上述方案所述的dsrna或上述方案所述的引物组或利用上述方案所述制备方法得到的dsrna在降低云杉花墨天牛嗅觉识别能力中的应用。
[0014]
本发明还提供了上述方案所述的dsrna或上述方案所述的引物组或利用上述方案所述制备方法得到的dsrna在制备降低云杉花墨天牛嗅觉识别能力的产品中的应用。
[0015]
本发明还提供了一种防治云杉花墨天牛的制剂，所述制剂包括上述方案所述的dsrna。
[0016]
本发明还提供了一种防治云杉花墨天牛的方法，包括：将上述方案所述的dsrna或利用上述方案所述制备方法得到的dsrna导入云杉花墨天牛体内。
[0017]
优选的，所述导入的方法包括注射。
[0018]
有益效果：
[0019]
本发明提供了一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsrna，所述dsrna包括dscsp3、dscsp5、dsobp14、dsobp28、dsor1和dssnmp1中的一种或多种；所述dscsp3的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述dscsp5的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述dsobp14的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述dsobp28的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述dsor1的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述dssnmp1的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.6所示。本发明提供的dsrna可以高效沉默云杉花墨天牛的嗅觉基因，能够导致云杉花墨天牛嗅觉识别能力下降，影响成虫交配，最终达到防治的效果，本发明为防治云杉花墨天牛提供了新的有效途径。实验结果表明：与注射egfp基因dsrna对照相比，当云杉花墨天牛注射本发明提供的dsrna后有较强的沉默效果，致使云杉花墨天牛嗅觉受到抑制。因此本发明提出可利用嗅觉基因的
沉默技术来防治松材线虫重要媒介昆虫云杉花墨天牛，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。
[0020]
另外，本发明为理解云杉花墨天牛的嗅觉识别机制、创制新的害虫分子调控制剂提供了理论基础。
附图说明
[0021]
图1为实施例1中云杉花墨天牛6个嗅觉基因dsrna电泳图；其中m为dl2000 marker，1为msalcsp3，2为msalcsp5，3为msalor1，4为msalobp28，5为msalsnmp1，6为msalobp14；
[0022]
图2为实施例2中在注射4μg相应的dsrna后2天和5天评估基因表达；β-actin作为参考基因，表达量为平均值
±
se(n＝4)，使用方差分析进行统计分析，其中*和**分别表示p《0.05和p《0.01的显著差异，ck：对照组。
具体实施方式
[0023]
本发明提供了一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsrna，所述dsrna包括dscsp3、dscsp5、dsobp14、dsobp28、dsor1和dssnmp1中的一种或多种。
[0024]
所述dscsp3的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体如下：gccttaattggcgtagttgctagtcagaaatatactacaaagtatgacaacgtcgacttggaccagatcattaaaagcgacaggctgttgaagaattatatagactgcgtgctggacagaggaaactgcactcccgatggagtggaactcaagaaaaaccttccggatgcacttttgacagactgcagcaaatgcagtgagacgcagaagaacggatcgaccaaaatcctgagacatttggtaaagaacaaacgcccctggttcgatgaattggctgccaaattcgaccccgacagctcctacaggaag；
[0025]
所述dscsp5的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：ttttcgtcgttttagttggtgtggcagctagccaaaaatacaccacgaagtatgacaatatagatttggatgaaattattaagagtgatcgtcttttgaagaactatatggattgtataatggagagaggcaattgtactccagatggccaagaactgaaaaagaatattccggatgctctagttacggattgcagcaaatgcagcgactggcagagagaaggcacaaggaaaatactcagacatttggtgataaacaagcgggaatggttcgacgaagtcgctggtaaatacgactcagaaggcgcctacagaaagaaacac；
[0026]
所述dsobp14的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体如下：tatggtgcaagcaattctggacgaatcggagttcactcctaaactattggaacaagtcaaagcacttcacgaaacatgtgtgggtcagacaggtgcagacgaaggactgattagtaaaatagcaaaaggagactttgtcgaagatcccaaaataaaggcttatatgaaatgtggcctcaccgaattaggagtgatgaatgataatggtgacatagacttagatatggtctccgaatttgttccaagcaaatatctgagtgcaagtctaactagtctaaagacttgcataggaaaaacaaaagatattgggaacttggaagaccgagtatatgctttgtttaaatgttactacgacttaaaccctgat；
[0027]
所述dsobp28的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.4所示，具体如下：cgttgcaggagctttggctcagctccctaatagcgaaaggatctttctgaagcaagtccatgattcctgccaagctgaccgtgccacttatgctgacgaaagccgtctgaagcagctcaacaaatacatcgatgatgccgtagttggaaatcacatgttgtgtatgtccaagaaagcgggtctccagaagggcaatggtgacttggatattggagttatcaaacagaagattgcccttgtgacagctgacaaatccaaggttgatggtctggtgaagaagtgtgctgtcgtcaatggaaacccacaaaagaccgccaatct；
[0028]
所述dsor1的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.5所示，具体如下：tgtagcgatgacgggagtgttaaagatggtttatctctacgtggacaaaagccgcgtgaactacttatacgacaccattaccacagaattttgggattatcgcatctacggaccacagctagagaaagaagccaaggctattttcaaatacgccaatcgcatcttgtggagttatattgcgaattccgttctttgtctaacgcttttccttatgttccctgtggcagatatgccttcggaaaacgacaggattttacccaacgtagtctggagtccagtggatttaaatcctagccccttatacgaaatcgtgtttatgattttgttcgtaaatggaatactgacttacttgggcaacgcggcgtacgattatttctactcgtattgcgtg；
[0029]
所述dssnmp1的其中一条链的核苷酸序列如seq id no.6所示，具体如下：tcgtttgcaccagatttatgcagatctctagtggccgaatttcagcaaaaaactaaatacgacggaatcccagtacgaaaatattctgcaactttaggcgatatgtccacaaatgagaatgaaaaatgctactgtcccacaccagaaacttgcttaaagaaaggcattatggacctttataaatgtataggtgttcctatctatgcaagtttacctcatttttatgaggctgatgaaggttacttgaaaggagttaaaggtctgaagccggacaaaagcaaacatgaaattgtaattctgtttgaaggaatgacaggaagcccagtttttgcaaagaaacgtctgcagtttaacatgcccttgagagcaaatccaaaagtggaattatttaacaactttactgagacgatattgccaatattttggatagaagagggagtg。
[0030]
本发明所述dscsp3可以特异性沉默云杉花墨天牛嗅觉基因msalcsp3，所述msalcsp3基因的序列号优选为mt008391.1。
[0031]
本发明所述dscsp5可以特异性沉默云杉花墨天牛嗅觉基因msalcsp5，所述msalcsp5基因的序列号优选为mt008393.1。
[0032]
本发明所述dsobp14可以特异性沉默云杉花墨天牛嗅觉基因msalobp14，所述msalobp14基因的序列号优选为mt008349.1。
[0033]
本发明所述dsobp28可以特异性沉默云杉花墨天牛嗅觉基因msalobp28，所述msalobp28基因的序列号优选为mt008363.1。
[0034]
本发明所述dsor1可以特异性沉默云杉花墨天牛嗅觉基因msalor1，所述msalor1基因的序列号优选为mt008404.1。
[0035]
本发明所述dssnmp1可以特异性沉默云杉花墨天牛嗅觉基因msalsnmp1，所述msalsnmp1基因的序列号优选为mt008451.1。
[0036]
本发明还提供了一种扩增上述dsrna的引物组，所述引物组包括引物对1～6中的一种或多种。
[0037]
本发明所述引物对1的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，具体为：taatacgactcactatagggccttaattggcgtag；所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示，具体为：taatacgactcactataggcttcctgtaggagctgtc；所述上下游引物下划线为t7启动子序列，下同。本发明所述引物对1可以特异性扩增得到dscsp3的其中一条链。
[0038]
所述引物对2的上游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，具体为：taatacgactcactataggttttcgtcgttttagttg；所述引物对2的下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示，具体为：taatacgactcactatagggtgtttctttctgtaggc。本发明所述引物对2可以特异性扩增得到dscsp5的其中一条链。
[0039]
所述引物对3的上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，具体为：taatacgactcactataggtatggtgcaagcaatt；所述引物对3的下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示，具体为：taatacgactcactataggatcagggtttaagtcgt。本发明所述引物对3可以特异性扩
增得到dsobp14的其中一条链。
[0040]
所述引物对4的上游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示，具体为：taatacgactcactataggcgttgcaggagctttg；所述引物对4的下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示，具体为：taatacgactcactataggagattggcggtctttt。本发明所述引物对4可以特异性扩增得到dsobp28的其中一条链。
[0041]
所述引物对5的上游引物的核苷酸序列如seq id no.15所示，具体为：taatacgactcactataggtgtagcgatgacgggagt；所述引物对5的下游引物的核苷酸序列如seq id no.16所示，具体为：taatacgactcactataggcacgcaatacgagtagaaataa。本发明所述引物对5可以特异性扩增得到dsor1的其中一条链。
[0042]
所述引物对6的上游引物的核苷酸序列如seq id no.17所示，具体为：taatacgactcactataggtcgtttgcaccagatt；所述引物对6的下游引物的核苷酸序列如seq id no.18所示，具体为：taatacgactcactataggcactccctcttctatcca。本发明所述引物对6可以特异性扩增得到dssnmp1的其中一条链。
[0043]
本发明还提供了一种上述方案中所述dsrna的制备方法，包括以下步骤：
[0044]
以云杉花墨天牛的cdna为模板，利用上述方案中所述的引物组进行pcr扩增，得到pcr产物；
[0045]
以所述pcr产物为模板，采用dsrna合成试剂盒制备得到所述dsrna。
[0046]
在本发明中，所述cdna的获取方法优选包括：按照invitrogen trizol试剂说明书，利用trizol法提取云杉花墨天牛成虫rna，再利用promega公司的goscript
tm reverse transcription system反转录为所述cdna。本发明及实施例对所述invitrogen trizol试剂的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
[0047]
在本发明中，当所述引物对为引物对1或引物对4时，所述pcr扩增的反应程序优选包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；
[0048]
当所述引物对为引物对2、引物对3或引物对6时，所述pcr扩增的反应程序优选包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；
[0049]
当所述引物对为引物对5时，所述pcr扩增的反应程序优选包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
[0050]
在本发明中，所述pcr扩增的反应体系优选以50μl计，包括：2
×
pcr supermix 25μl、上述引物对中的上下游引物各2μl、cdna 2μl和余量的ddh2o；所述pcr supermix优选包括北京全式金生物技术有限公司的pcr supermix(+dye)；上下游引物的工作浓度均优选为10μm。
[0051]
在本发明中，所述dsrna合成试剂盒优选包括megascript rnai kit试剂盒。本发明对所述megascript rnai kit试剂盒试剂盒的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
[0052]
本发明还提供了上述的dsrna或上述的引物组或利用上述制备方法得到的dsrna在防治云杉花墨天牛中的应用。本发明提供的dsrna可以高效沉默云杉花墨天牛的嗅觉基因，能够导致云杉花墨天牛嗅觉识别能力下降，影响成虫交配，最终达到防治的效果。
[0053]
本发明还提供了上述的dsrna或上述的引物对或利用上述制备方法得到的dsrna在制备防治云杉花墨天牛的产品中的应用。
[0054]
本发明还提供了上述的dsrna或上述的引物组或利用上述制备方法得到的dsrna在降低云杉花墨天牛嗅觉识别能力中的应用。本发明提供的dsrna可以高效沉默云杉花墨天牛的嗅觉基因，能够导致云杉花墨天牛嗅觉识别能力下降。
[0055]
本发明还提供了上述的dsrna或上述的引物对或利用上述制备方法得到的dsrna在制备降低云杉花墨天牛嗅觉识别能力的产品中的应用。
[0056]
本发明还提供了一种防治云杉花墨天牛的制剂，所述制剂包括上述的dsrna。
[0057]
本发明还提供了一种防治云杉花墨天牛的方法，包括：将上述技术方案所述的dsrna或利用上述技术方案所述制备方法得到的dsrna导入云杉花墨天牛体内。
[0058]
在本发明中，所述导入的方法优选包括注射，所述注射的剂量优选为4μg/只。本发明将所述dsrna微量注射入云杉花墨天牛成虫体内，可以高效特异沉默云杉花墨天牛6个视觉基因的mrna表达，能够导致云杉花墨天牛嗅觉识别能力下降，影响成虫交配，最终达到防治的效果。
[0059]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种靶向云杉花墨天牛嗅觉基因的dsrna、引物对及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0060]
实施例1
[0061]
按照invitrogen trizol试剂说明书，利用trizol法提取云杉花墨天牛成虫rna，再利用promega公司的goscript
tm reverse transcription system反转录得到cdna。
[0062]
根据云杉花墨天牛6个嗅觉基因序列(seq id no.19～24所示)，设计合成云杉花墨天牛嗅觉基因dsrna的引物对1～6，所述引物对1的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述引物对2的上游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述引物对2的下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；
[0063]
所述引物对3的上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示；所述引物对3的下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示；所述引物对4的上游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述引物对4的下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；所述引物对5的上游引物的核苷酸序列如seq id no.15所示；所述引物对5的下游引物的核苷酸序列如seq id no.16所示；所述引物对6的上游引物的核苷酸序列如seq id no.17所示；所述引物对6的下游引物的核苷酸序列如seq id no.18所示。
[0064]
以上述cdna为模板，利用引物对1～6扩增得到的片段长度分别为dscsp3 309bp(seq id no.1所示)，dscsp5 323bp(seq id no.2所示)，dsobp14 367bp(seq id no.3所示)，dsobp28 321bp(seq id no.4所示)，dsor1 391bp(seq id no.5所示)和dssnmp1 441bp(seq id no.6所示)，通过体外dsrna合成试剂盒获得云杉花墨天牛嗅觉基因的dsrna。
[0065]
具体合成步骤为：通过pcr扩增目的条带，pcr扩增的反应体系为pcr supermix(+dye)(全式金)25μl、上下游引物各2μl(浓度10μm)、cdna 2μl、ddh2o补足至50μl；
[0066]
所述引物对为引物对1或4时，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；
[0067]
所述引物对为引物对2、3或6时，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；
[0068]
所述引物对为引物对5时，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；
[0069]
扩增产物经电泳检测确认后作为模板合成dsrna(参照megascript rnai kit试剂盒说明书)，于微量分光光度计检测dsrna浓度，并取1μl dsrna于1％琼脂糖凝胶电泳检测确认(见图1)，-80℃保存备用，得到6种dsrna，分别为dscsp3、dscsp5、dsobp14、dsobp28、dsor1和dssnmp1。
[0070]
对比例1
[0071]
一种egfp基因的dsrna，记为dsegfp，参照文献【fan z,zhang z,zhang x,kong x,liu f and zhang s(2022)five visual and olfactory target genes for rnai in agrilus planipennis.front.genet.13:835324.doi:10.3389/fgene.2022.835324】公开的方法构建得到。
[0072]
实施例2
[0073]
云杉花墨天牛lw1嗅觉基因沉默效果的检测
[0074]
挑取30头大小一致、生长状况良好的云杉花墨天牛用于dsrna注射，平均分成两组，dscsp3组和ck组，将实施例1合成的dscsp3(dscsp3组)和对比例1合成的dsegfp(ck组)，分别微注射入两组云杉花墨天牛成虫，注射量均为4μg/头，分别于2天和5天后，分别从两组中选取4头状况良好的云杉花墨天牛作为一个生物学重复，运用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测msalcsp3基因的相对表达量，检测结果取平均值；
[0075]
挑取30头大小一致、生长状况良好的云杉花墨天牛用于dsrna注射，平均分成两组，dscsp5组和ck组，将实施例1合成的dscsp5(dscsp5组)和对比例1合成的dsegfp(ck组)，分别微注射入两组云杉花墨天牛成虫，注射量均为4μg/头，分别于2天和5天后，分别从两组中选取4头状况良好的云杉花墨天牛作为一个生物学重复，运用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测msalcsp5基因的相对表达量，检测结果取平均值；
[0076]
挑取30头大小一致、生长状况良好的云杉花墨天牛用于dsrna注射，平均分成两组，dsobp14组和ck组，将实施例1合成的dsobp14(dsobp14组)和对比例1合成的dsegfp(ck组)，分别微注射入两组云杉花墨天牛成虫，注射量均为4μg/头，分别于2天和5天后，分别从两组中选取4头状况良好的云杉花墨天牛作为一个生物学重复，运用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测msalobp14基因的相对表达量，检测结果取平均值；
[0077]
挑取30头大小一致、生长状况良好的云杉花墨天牛用于dsrna注射，平均分成两组，dsobp28组和ck组，将实施例1合成的dsobp28(dsobp28组)和对比例1合成的dsegfp(ck组)，分别微注射入两组云杉花墨天牛成虫，注射量均为4μg/头，分别于2天和5天后，分别从两组中选取4头状况良好的云杉花墨天牛作为一个生物学重复，运用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测msalobp28基因的相对表达量，检测结果取平均值；
[0078]
挑取30头大小一致、生长状况良好的云杉花墨天牛用于dsrna注射，平均分成两组，dsor1组和ck组，将实施例1合成的dsor1(dsor1组)和对比例1合成的dsegfp(ck组)，分
别微注射入两组云杉花墨天牛成虫，注射量均为4μg/头，分别于2天和5天后，分别从两组中选取4头状况良好的云杉花墨天牛作为一个生物学重复，运用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测msalor1基因的相对表达量，检测结果取平均值；
[0079]
挑取30头大小一致、生长状况良好的云杉花墨天牛用于dsrna注射，平均分成两组，dssnmp1组和ck组，将实施例1合成的dssnmp1(dssnmp1组)和对比例1合成的dsegfp(ck组)，分别微注射入两组云杉花墨天牛成虫，注射量均为4μg/头，分别于2天和5天后，分别从两组中选取4头状况良好的云杉花墨天牛作为一个生物学重复，运用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测msalsnmp1基因的相对表达量，检测结果取平均值。
[0080]
上述荧光定量pcr的方法为：采用trizol(invitrogen)提取总rna，采用goscript
tm reverse transcription system试剂盒(promega)合成cdna第一条链，以此为模板，运用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测注射后msalcsp3、msalcsp5、msalor1、msalobp28、msalsnmp1和msalobp14嗅觉基因的表达量(内参基因为translation elongation factor 1 alpha(ef1a))，具体方法参见(shen s,fan z,zhang x,et al.the characteristics ofchemosensory and opsin genes in newly emerged and sexually mature agrilus planipennis,an important quarantine forest beetle[j].frontiers in genetics,2021,11.)。
[0081]
qrt-pcr所涉及引物序列为：msalcsp3-f：tggccttaattggcgtagttg(seq id no.19)；msalcsp3-r：cgatccgttcttctgcgtct(seq id no.20)；
[0082]
msalcsp5-f：ggatgctctagttacggattgc(seq id no.21)；msalcsp5-r：tcttcgcggtgtttctttct(seq id no.22)；
[0083]
msalobp14-f：tgacggtgctcgcactctta(seq id no.23)；msalobp14-r：attcggtgaggccacatttc(seq id no.24)；
[0084]
msalobp28-f：ctgaccgtgccacttatgct(seq id no.25)；msalobp28-r：cccttctggagacccgcttt(seq id no.26)；
[0085]
msalor1-f：acacggtgatggaaaggatg(seq id no.27)；msalor1-r：ctgaaagattgaatagggttatg(seq id no.28)；
[0086]
msalsnmp1-f：catgtcagtgaaagcgaact(seq id no.29)；msalsnmp1-r：taaatctggtgcaaacgaag(seq id no.30)。
[0087]
注射dsrna云杉花墨天牛lw1嗅觉基因表达水平如图2和表1所示。
[0088]
表1注射dsrna后不同时间嗅觉基因表达水平(相对内参基因的表达量)
[0089]
组别注射后2天注射后5天组别注射后2天注射后5天ck1.040.55ck1.651.88dscsp30.170.04dscsp50.440.48组别注射后2天注射后5天组别注射后2天注射后5天ck1.9212.55ck1.9911.14dsobp140.210.31dsobp280.5822.78组别注射后2天注射后5天组别注射后2天注射后5天ck1.220.73ck2.044.26dsor10.490.20dssnmp10.211.78
[0090]
由表1和图2可知，在注射dsrna2天后，所有6个基因都显著下调，其中4个基因的沉默效应至少持续5天(图2)。在dsrna注射后2天，csp3 mrna的相对表达水平降低了83.51％，在注射后5天进一步降低了92.42％(图2a)。注射dscsp5后2天和5天，csp5的相对表达分别减少73.47％和74.32％(图2b)。obp14的沉默效果显著，注射dsrna后第2天该基因的表达水平降低了88.63％，第5天降低了97.53％(图2c)。在dsor1注射后2天和5天，or1的相对表达水平分别降低59.90％和72.21％(图2e)。在dsrna注射后2天，obp28和snmp1的相对表达水平分别降低了70.78％和89.71％(图2d，f)；然而，在注射后第五天，沉默效果变得不明显。
[0091]
综上所述，本发明提供的dsrna可以高效沉默云杉花墨天牛的嗅觉基因，能够导致云杉花墨天牛嗅觉识别能力下降，影响成虫交配，最终达到防治的效果。
[0092]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。