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一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-05-10 02:07

本发明涉及植物生物学技术领域，尤其涉及一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法。

背景技术：

根癌农杆菌介导法是草莓遗传转化的重要方法，它是以草莓的叶片、叶柄、原生质体和愈伤组织等为外植体，经农杆菌浸染后，通过抗生素筛选、器官发生获得再生植株，其中以“叶盘法”应用的最为普遍。

传统的“叶盘法”存在遗传转化效率低、杂菌污染严重、不定芽再生困难、容易产生嵌合体和假阳性植株等问题，从而导致筛选工作量大、转基因植株获取困难。而随着草莓基因组学研究的深入，揭示基因功能及其表达时空性已成为后基因组时代的重要课题，转基因技术作为研究基因功能的最有效的手段之一已发挥着越来越重要的作用。因此，建立一种高效稳定的草莓遗传转化方法对批量验证基因功能就显得尤为重要。

技术实现要素：

为克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法，其优化了遗传转化的步骤，从而大幅度提高了草莓转基因效率，解决了传统农杆菌介导法转化效率低，易产生嵌合体，筛选困难，工作量大的问题，极大的提高了遗传转化效率，同时显著降低了再生芽的假阳性率。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,其包括：

草莓无菌苗的预培养：取草莓无菌苗，获得其叶盘或剪成小块，置于M1培养基中进行暗培养，获得预培养叶片；

农杆菌活化：取根癌农杆菌阳性单克隆于含抗生素的YEB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养，获得菌液；取获得的菌液离心收菌，获得菌体沉淀；将获得的菌体沉淀重悬于M2培养基中，振荡培养，获得用于侵染的菌液；

侵染：将获得的所述预培养叶片置于所述用于侵染的菌液中，进行侵染处理；

共培养：吸干经侵染处理后的叶片表面的菌液，置于M3培养基中，进行暗培养；

延迟筛选：用M4洗涤液洗涤经共培养结束后的叶片，并吸干其表面的菌液，再接种于M5培养基上，进行暗培养；

筛选：将延迟筛选结束后的叶片转移至M6培养基中，光照和黑暗交替培养，培养结束后，切除坏死组织，将俞伤组织部分转接于M7培养基中，光照和黑暗交替培养，直到分化出不定芽；

生根：待芽长长后，将其切下转移至M8培养基中再培养，得到完整植株。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述根癌农杆菌为LBA4404农杆菌或GV3101农杆菌。

进一步，所述M3培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50～150μmol/L的а-硫辛酸，且其PH值为5.5。

采用上述进一步方案的有益效果是：利用含有上述成分的M3培养基，通过加入适宜浓度的а-硫辛酸，能够缓解农杆菌浸染植物过程中产生的“氧爆反应”，清除活性氧和自由基，减缓植物组织的褐化，促进转基因芽的再生。

进一步，所述M5培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及50～150μmol/L井冈霉素A，且其PH值为5.8。

采用上述进一步方案的有益效果是：在草莓遗传转化过程中添加适宜浓度的а-硫辛酸和井冈霉素A，极大的提高了遗传转化效率，同时显著降低了再生芽的假阳性率，转化效率是传统的农杆菌介导法的两倍以上。

进一步，所述M1培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶和0.1～3mg/L激素；且其PH值为5.8。

进一步，所述M2培养基的成分包括MS、B5维生素、2％蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮，且其PH值为5.5。

进一步，所述M4洗涤液的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖及200～500mg/L抗生素，且其PH值为5.8。

进一步，所述M6、M7培养基的成分均包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素及200～500mg/L抗生素，且M6、M7培养基的PH值均为5.8；其中所述M6中，所加入的抗生素包括5mg/L的潮霉素或10mg/L的硫酸卡那霉素，所述M7中，所加入的抗生素包括10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。

进一步，所述M8培养基的成分包括MS或1/2MS、0～0.5mg/L激素和1～5mg/L抗生素，其PH为5.8。

进一步，在延迟筛选培养中，接种于M5培养基上进行培养的条件是22℃条件下暗培养6天；在筛选培养中，所述光照和黑暗交替培养具体为16小时的光照培养和8小时的黑暗培养交替培养15～20天，在交替培养15～20天后再重复筛选培养过程一次。

与现有技术相比，本发明提供的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法，其通过在共培养和延迟筛选阶段加入а-硫辛酸(Lipoic acid)和井冈霉素A(Validamycin A)，同时优化遗传转化步骤，从而大幅度提高了草莓转基因效率，解决了传统农杆菌介导法转化效率低，易产生嵌合体，筛选困难，工作量大的问题，极大的提高了遗传转化效率，同时显著降低了再生芽的假阳性率。

附图说明

图1为本发明提供的根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法的流程图；

图2为‘红颜’草莓遗传转化过程的效果图；

图3为‘丰香’草莓转基因植株的效果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

如图1所示，本实施例示例性地给出了根癌农杆菌介导的草莓高效稳定的遗传转化方法,具体包括：

S1：草莓无菌苗的预培养：取草莓无菌苗，获得其叶盘或剪成小块，置于M1培养基中进行暗培养，获得预培养叶片；

S2：农杆菌活化：取根癌农杆菌阳性单克隆于含抗生素的YEB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养，获得菌液；取获得的菌液离心收菌，获得菌体沉淀；将获得的菌体沉淀重悬于M2培养基中，振荡培养，获得用于侵染的菌液；

S3：侵染：将获得的所述预培养叶片置于所述用于侵染的菌液中，进行侵染处理；

S4：共培养：吸干经侵染处理后的叶片表面的菌液，置于M3培养基中，进行暗培养；

S5：延迟筛选：用M4洗涤液洗涤经共培养结束后的叶片，并吸干其表面的菌液，再接种于M5培养基上，进行暗培养；

S6：筛选：将延迟筛选结束后的叶片转移至M6培养基中，光照和黑暗交替培养，培养结束后，切除坏死组织，将俞伤组织部分转接于M7培养基中，再光照和黑暗交替培养，直到分化出不定芽；

S7：生根：待芽长长后，将其切下转移至M8培养基中再培养，得到完整植株。

具体地，在预培养阶段，取10～30天叶龄的草莓无菌组培苗，沿垂直于主叶脉的方向剪成5毫米x 3毫米的条状小块或用打孔器打出直径约为5毫米的叶盘，置于含25毫升M1培养基的培养皿中，以叶片远轴面与培养基接触，每个培养皿中放10-16个，封口，25℃暗培养3天。

在农杆菌活化阶段，挑农杆菌阳性单克隆于25毫升含抗生素的YEB液体培养基中，黑暗条件下28℃，150转/分钟振荡培养20-24小时，取6毫升菌液于6000转/分钟离心5分钟收菌，将菌体沉淀重悬于25毫升M2培养基中，28℃，150转/分钟振荡培养3-4小时至OD600＝0.1～0.3(约108cfu/ml)，此即为用于浸染的菌液。

在侵染阶段，将预培养3天后的叶片放入制备好的农杆菌悬浮液中，浸染15-20分钟，每隔5分钟轻轻摇动几次。

在共培养阶段，将浸染结束后叶片放在滤纸上吸干表面的菌液，置于含25毫升M3培养基的培养皿中，每个培养皿放10-16个，封口，25℃暗培养2-3天。

在延迟筛选阶段，将共培养结束后的叶片用M4洗涤液洗涤3次，每次20分钟，期间轻摇一次，然后置于滤纸上吸干表面菌液，接种于含25毫升M5培养基的培养皿上，每个培养皿放10-16个，封口，22℃暗培养6天。

在筛选阶段，将延迟筛选结束后的叶片转移至含40毫升M6筛选培养基的培养瓶中，每个培养瓶放10个，培养条件为16小时(光)/8小时(暗)，光强约为2200勒克斯，温度22℃，培养15-20天，重复该操作一次，即，将培养15-20天后的叶片再转移至含40毫升M6筛选培养基的培养瓶中，每个培养瓶放10个，培养条件为16小时(光)/8小时(暗)，光强约为2200勒克斯，温度22℃，培养15-20天，完成培养。培养结束后，切除坏死的组织，将绿色的愈伤组织部分转接于新的筛选培养基M7中，培养条件相同，培养15-20天，之后每15-20天转一次瓶，直到分化出不定芽。

在生根培养阶段，待再生芽长到2cm以上，则将其从基部切下转移至M8培养基中再培养，得到完整植株。

在本发明优选的实施方式中，所采用的根癌农杆菌为LBA4404农杆菌或GV3101农杆菌。在草莓无菌苗的预培养阶段，所采用的M1培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶和0.1～3mg/L激素；且其PH值为5.8。在农杆菌活化阶段，所采用的M2培养基的成分包括MS、B5维生素、2％蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮，且其PH值为5.5。在共培养阶段，所采用的M3培养基的成分包括MS无机盐、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50～150μmol/L的а-硫辛酸，且其PH值为5.5。在延迟筛选阶段，所采用的M4洗涤液的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖及200～500mg/L抗生素，且其PH值为5.8；所采用的M5培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及50～150μmol/L井冈霉素A，且其PH值为5.8。在筛选阶段，所采用的M6培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及5mg/L潮霉素或10mg/L硫酸卡那霉素；所采用的M7培养基的成分包括MS、B5维生素、3％蔗糖、0.25％植物凝胶、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。在生根阶段，所采用的M8培养基的成分包括MS或1/2MS、0～0.5mg/L激素和1～5mg/L抗生素，其PH为5.8。

需要说明的是，在上述阶段中，抗生素、а-硫辛酸和井冈霉素A全部采用过滤灭菌后待培养基冷却至60℃左右加入。所使用的根癌农杆菌为LBA4404或GV3101；转基因的质粒为pBI121(硫酸卡那霉素抗性)、pCAMBIA1301(潮霉素抗性)、pCAMBIA1302(潮霉素抗性)或以其为骨架改造而成的质粒，使用其它抗性的质粒时需要改变为对应的抗生素。

采用本发明提供的遗传转化方法，本实施例分别以‘红颜’草莓和‘丰香’草莓的转基因遗传转化为例，实验其遗传转化效果。

示例1，以‘红颜’草莓为例，采用本发明提供的遗传转化方法，实验其遗传转化效果。

1)预培养：取10-30天叶龄的‘红颜’草莓无菌组培苗，用打孔器打出直径约为5毫米的叶盘，置于含25毫升M1培养基的培养皿中，以叶片远轴面与培养基接触，每个培养皿中放16个，封口，25℃暗培养3天；如图2中的a所示，为预培养阶段的‘红颜’草莓遗传转化效果图。

2)农杆菌活化：挑农杆菌GV3101阳性单克隆于25毫升含抗生素(50mg/L硫酸卡那霉素+20mg/L利福平)的YEB液体培养基中，黑暗条件下28℃，150转/分钟振荡培养20小时，取6毫升菌液于6000转/分钟离心5分钟收菌，将菌体沉淀重悬于25毫升M2培养基中，28℃，150转/分钟振荡培养3-4小时至OD600＝0.1(约108cfu/ml)，此即为用于浸染的菌液；

3)浸染：将预培养3天后的叶片放入制备好的农杆菌悬浮液中，浸染20分钟，每隔5分钟轻轻摇动几次；

4)共培养：浸染结束后将叶片放在滤纸上吸干表面的菌液，置于含25毫升M3培养基的培养皿中，每个培养皿放16个，封口，25℃暗培养2天；如图2中的b所示，为共培养阶段的‘红颜’草莓遗传转化效果图。

5)延迟筛选：将共培养结束后的叶片用M4洗涤3次，每次20分钟，期间轻摇一次，然后置于滤纸上吸干表面菌液，接种于含25毫升M5培养基的培养皿上，每个培养皿放16个，封口，22℃暗培养6天；如图2中的c所示，为延迟筛选阶段的‘红颜’草莓遗传转化效果图。

6)筛选：将延迟筛选结束后的叶片转移至含40毫升M6筛选培养基的培养瓶中，每个培养瓶放10个，培养条件为16小时(光)/8小时(暗)，光强约为2200勒克斯，温度22℃，培养20天，重复该操作一次。培养结束后，切除坏死的组织，将绿色的愈伤组织部分转接于新的M7筛选培养基中，培养条件相同，培养20天，之后每20天转一次瓶，直到分化出不定芽；如图2中的d所示，为筛选阶段的‘红颜’草莓遗传转化效果图。

7)生根：待再生芽长到2cm以上，则将其从基部切下转移至M8培养基中再培养，得到完整植株。如图2中的e所示，为再生芽的培养及生根阶段的‘红颜’草莓遗传转化效果图。如图2中的f所示，为获得的‘红颜’草莓转基因植株。

需要说明的是：本示例的方法中使用的根癌农杆菌为GV3101；转基因的质粒为pCAMBIA1301。

上述示例的方法中，M1培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+噻苯隆(TDZ)2.0mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L，pH＝5.8；M2培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+2％蔗糖+100微摩尔/升乙酰丁香酮，pH＝5.5；M3培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+100μmol/L乙酰丁香酮+50μmol/Lа-硫辛酸，pH＝5.5；M4洗涤液的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+250mg/L 特美汀(Timentin)+250mg/L头孢噻肟钠(Cefotaxime)，pH＝5.8；M5培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+250mg/L Timentin+250mg/L Cefotaxime+100μmol/L井冈霉素A，pH＝5.8；M6培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+250mg/L Timentin+250mg/L Cefotaxime+5mg/L潮霉素，pH＝5.8；M7培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+250mg/L Timentin+250mg/L Cefotaxime+10mg/L潮霉素，pH＝5.8；M8培养基的组成为：MS+0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.1mg/L的萘乙酸(NAA)+1mg/L潮霉素，pH＝5.8。

示例2，以‘丰香’草莓为例，采用本发明提供的遗传转化方法，实验其遗传转化效果。

1)预培养：取10-30天叶龄的‘丰香’草莓无菌组培苗，用打孔器打出直径约为5毫米的叶盘，置于含25毫升M1培养基的培养皿中，以叶片远轴面与培养基接触，每个培养皿中放16个，封口，25℃暗培养3天；

2)农杆菌活化：挑农杆菌LBA4404阳性单克隆于25毫升含抗生素(50mg/L硫酸卡那霉素+20mg/L利福平)的YEB液体培养基中，黑暗条件下28℃，150转/分钟振荡培养24小时，取6毫升菌液于6000转/分钟离心5分钟收菌，将菌体沉淀重悬于25毫升M2培养基中，28℃，150转/分钟振荡培养3-4小时至OD600＝0.3(约108cfu/ml)，此即为用于浸染的菌液；

3)浸染：将预培养3天后的叶片放入制备好的农杆菌悬浮液中，浸染15分钟，每隔5分钟轻轻摇动几次；

4)共培养：浸染结束后将叶片放在滤纸上吸干表面的菌液，置于含25毫升M3培养基的培养皿中，每个培养皿放16个，封口，25℃暗培养3天；

5)延迟筛选：将共培养结束后的叶片用M4洗涤3次，每次20分钟，期间轻摇一次，然后置于滤纸上吸干表面菌液，接种于含25毫升M5培养基的培养皿上，每个培养皿放16个，封口，22℃暗培养6天；

6)筛选：将延迟筛选结束后的叶片转移至含40毫升M6筛选培养基的培养瓶中，每个培养瓶放10个，培养条件为16小时(光)/8小时(暗)，光强约为2200勒克斯，温度22℃，培养15天，重复该操作一次。培养结束后，切除坏死的组织，将绿色的愈伤组织部分转接于新的M7筛选培养基中，培养条件相同，培养15天，之后每15天转一次瓶，直到分化出不定芽；

7)生根：待再生芽长到2cm以上，则将其从基部切下转移至M8培养基中再培养，得到完整植株。如图3所示，为获得的‘丰香’草莓转基因植株。

需要说明的是：本示例中的方法所使用的根癌农杆菌为LBA4404；转基因的质粒为pBI121。

上述方法中，M1培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.6mg/L，pH＝5.8；M2培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+2％蔗糖+100微摩尔/升乙酰丁香酮，pH＝5.5；M3培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 2.0mg/L+IBA0.6mg/L+100微摩尔/升乙酰丁香酮+50微摩尔/升а-硫辛酸，pH＝5.5；M4洗涤液的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+250mg/LTimentin+250mg/LCefotaxime，pH＝5.8；M5培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.6mg/L+250mg/LTimentin+250mg/LCefotaxime+100微摩尔/升井冈霉素A，pH＝5.8；M6培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.6mg/L+250mg/LTimentin+250mg/LCefotaxime+10mg/L硫酸卡那霉素，pH＝5.8；M7培养基的组成为：MS无机盐+B5维生素+3％蔗糖+0.25％植物凝胶+TDZ 0.6mg/L+IBA 0.6mg/L+250mg/L Timentin+250mg/L Cefotaxime+30mg/L硫酸卡那霉素，pH＝5.8；M8培养基的组成为：MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+5mg/L硫酸卡那霉素，pH＝5.8。

综上，本发明提出的草莓遗传转化方法，其优点是：

1.遗传转化效率高，假阳性率低。本发明通过在草莓遗传转化过程中添加适宜浓度的а-硫辛酸和井冈霉素A，极大的提高了遗传转化效率，同时显著降低了再生芽的假阳性率，转化效率是传统的农杆菌介导法的两倍以上。

2.促进转基因芽的再生。本发明中添加的а-硫辛酸能够缓解农杆菌浸染植物过程中产生的“氧爆反应”，清除活性氧和自由基，减缓植物组织的褐化，促进转基因芽的再生。

3.降低嵌合体的产生。本发明中采用逐步提高筛选抗生素浓度的方法，能够较好的避免嵌合体的产生，同时又不会对不定芽的诱导产生显著影响。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。