分子医学技能

1、E玫瑰花环形成实验 掌握掌握E花环形成的原理花环形成的原理; u熟悉熟悉E花环形成实验的步骤及光镜下花环形成实验的步骤及光镜下E 花环的形态。花环的形态。 u熟悉磁珠分离的原理熟悉磁珠分离的原理 实验目的实验目的 T T细胞的表面分子细胞的表面分子是是T T细胞与其细胞与其 它细胞和分子间相互识别及作它细胞和分子间相互识别及作 用的物质基础。它们在用的物质基础。它们在T T细胞活细胞活 化、增殖和分化等过程中起重化、增殖和分化等过程中起重 要作用。要作用。 TCR-CD3 TCR-CD3复合物参与复合物参与T T细胞的细胞的 抗原识别和信号转导；抗原识别和信号转导； CD2 CD2、CD28C

2、D28、CTLA-4CTLA-4、CD45CD45、 CD40L CD40L 等膜蛋白参与等膜蛋白参与T T细胞活化细胞活化 及及T T细胞与其它细胞间相互作用。细胞与其它细胞间相互作用。 CD4/CD8 CD4/CD8分子辅助分子辅助TCRTCR识别结识别结 合抗原，参与信号转导；根据合抗原，参与信号转导；根据 CD4CD4和和CD8CD8分子的表达将其分为分子的表达将其分为 CD4CD4+ +T T和和CD8CD8+ +T T细胞。细胞。 实验原理实验原理 T细胞细胞 CD2 CD3 TCR CD8 密度梯度离心法密度梯度离心法 CD4 绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBCSRBC）受体：即人

3、）受体：即人类类T细细 胞表面的胞表面的CD2分子。它分子。它能与能与SRBC结合结合 形成玫瑰花环样结构，可在光学显微形成玫瑰花环样结构，可在光学显微 镜镜下观察计数。因花环形成后比重变下观察计数。因花环形成后比重变 大，采用密度梯度离心即可将大，采用密度梯度离心即可将T T细胞从细胞从 其他淋巴细胞中分离出来。其他淋巴细胞中分离出来。 依靠表面标记的分离方法 E花环分离法 流式细胞术分离法：利用各种荧光素标记的表面标 记特异性抗体，使不同表面标记的细胞结合上不 同的荧光素，借助荧光活化细胞分选仪将各种细 胞分离开来。 免疫磁珠分离法：将某种表面标记特异性抗体包被 在磁性微珠上，与磁珠交联的

4、抗体能够特异性结 合具有这种表面标记的细胞结合，然后用强磁场 可将具有这种表面标记的细胞分离出来。 * * * 免疫磁珠法分离细胞免疫磁珠法分离细胞 实验方案 取外周血取外周血 绵羊红细胞绵羊红细胞 淋巴细胞淋巴细胞 分离分离 显微镜下观察显微镜下观察 + 实验材料实验材料 1.肝素抗凝血肝素抗凝血 2.Hanks液液 3.淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 4.绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液 5.灭活小牛血清灭活小牛血清 6.水平离心机、水平离心机、37温箱、显微镜等。温箱、显微镜等。 实验步骤实验步骤 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 用用Hanks液配成液配成 10106 6细胞细胞/0.1/0.1

5、mlml 加等量灭活小牛血清加等量灭活小牛血清(0.1ml) 加入加入0.50.5绵羊红细胞绵羊红细胞0.2ml 混匀，混匀，3737温箱放置温箱放置5 5分钟分钟 1000rpm离心离心5min 剩余细胞约剩余细胞约0.1ml 剩余细胞约剩余细胞约100ul， 加入加入100ul小牛血清，混匀小牛血清，混匀 （只有只有1管，到讲台前加管，到讲台前加） SRBC 将将200ul血清血清/细胞混合液，细胞混合液， 转移至转移至SRBC管（绵羊红管（绵羊红 细胞），混匀细胞），混匀 37度温箱放置度温箱放置5min 小牛血清小牛血清 血清血清/细胞悬液细胞悬液 绵羊红细胞绵羊红细胞 T细胞/绵羊红

6、细胞反应 加加1 1小滴小滴1 1美蓝美蓝，用毛细吸管轻轻混匀，用毛细吸管轻轻混匀 取取1 1滴于玻片上，加上盖玻片滴于玻片上，加上盖玻片 高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞 置置44冰箱冰箱 5min 45min 4度度30min 结束后结束后 1%美蓝美蓝 加加1 1小滴小滴1 1美蓝美蓝，用，用 毛细吸管轻轻混匀毛细吸管轻轻混匀 取取1 1滴于玻片上，加上盖玻片，滴于玻片上，加上盖玻片， 注意一端接触载玻片，缓慢放注意一端接触载玻片，缓慢放 下另一端，避免产生气泡下另一端，避免产生气泡 美蓝染色 实验结果实验结果 u凡能结合三个以上绵羊红细胞者为凡能结合三个以上绵羊

7、红细胞者为 玫瑰花形成玫瑰花形成阳性细胞阳性细胞。 正常人的花环形成率正常人的花环形成率50-70%，大致可大致可 以代表周围血中以代表周围血中T T细胞的百分数。细胞的百分数。 左左:（甲紫染色，（甲紫染色，800）：可见）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞；淋巴细胞； 右右:（吖啶橙染色）：图中可见（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。 T T淋巴细胞玫瑰花环淋巴细胞玫瑰花环 T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500 测定外周血中的测定外周血中的T细胞数，观察受检细胞数，观察受检 者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效。者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效。 观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶观察免疫抑制剂的效果，协助进行

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