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长春花内生真菌的分离及其发酵产生药用成分的初步研究

来源：花匠小妙招时间：2025-05-07 00:02

内生菌

anticanceractivity1

Keywords　　Catharanthusroseus(L1)G1Don　endophyticfungus　Fusariumoxysporum　vincristine

　　长春花Catharanthusroseus(L.)Don为夹竹桃科长春花属多年生草本植物,全草均可药用,有较高药用价值[1]。五十年代末,发现长春碱和长春新碱具有抗肿瘤活性,尤其对白血病具显著疗效。此后,从长春花不同部位分离出100多种生物碱,但这些生物碱在植物体内含量低,且植物生长缓慢,资源短缺,限制了抗癌药物的进一步开发。人们又转而进行植物组培研究[2,3],但植物组培成本高,生产难度大,有效成分含量低,也未能成功应用于生产[4]。由于植物真菌对植物某些药效成分的形成有重要影响,甚至会产生和其寄主相同或相似的生理活性成分[5,6],而且真菌易于培养,可以通过育种手段和控制培养条件等措施来大幅度提高其有效成分的含量,并便于组织工业化生产。故利用微生物生产抗癌成分前景十分广阔。和研究、。,孢属(Altem)真菌的工作外[7],在国内外尚未见报道。1　材料和方法

111　材料:新鲜长春花(2～3年)来源于云南大理

的茎段周围无任何菌长出,多次重复均如此,证明所

分到的菌是韧皮部内的,而不是表面的附生菌。114　内生真菌的液体培养:液体培养基为基本培养基(MM),将1000mL培养液分装在250mL的三角瓶中。用接种钩挑取少许菌丝接种于培养瓶中,置于27℃摇床(100r ～4d,待菌丝体长min)培养3好后进行提取。

115　提取方法:发酵液1000mL→碱化(pH>8)→离心(2500r min,15min)→沉淀→加CHCl3→浓缩→置青霉素小瓶中备用。116　检测方法

11611　TCL检测硅胶板::=8∶2;显色6::MAN421A控,;163可变波长检测器,427积分仪。

条件:检测波长Κ=238nm,吸光度015;泵A(重蒸水)1～115×69Pa;泵B(甲醇)1～115×69Pa。

流速:015mL 泵B70%。min;泵A30%、2　结果与讨论

211　长春花内生真菌97CG3的形态特征及生长特

弥渡县、巍山县和西双版纳州。硫酸长春新碱

(vincristinesulfate)对照品购自上海华联制药公司和Sigma公司。

112　培养基[8]:马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、查氏

培养基、改良的MM培养基。

113　内生真菌的分离:按常规无菌操作。取长春花不同部位的叶和茎干,按下列程序表面消毒:自来水冲洗→75%酒精漂洗(3～5min)→无菌水冲洗3～4次→011%升汞漂洗(10～30s)→无菌水冲洗5次。

将上述处理过的叶片和茎在超净台条件下切割成约015cm×015cm的小片(茎取韧皮部),然后将小片种植于PDA平板上,置28℃温箱培养3～7d后,即可见样品切割过的边缘有菌丝长出,经纯化后转接到PDA斜面上备用。

为了检查表面消毒是否彻底,做了对照实验。将上述同样条件处理过的茎段不作切割直接种植于PDA平皿上,置于相同的条件下培养,结果对照用

性:从云南不同地点生长的长春花的茎和叶中分离出20多个真菌菌株,其中有一菌株97CG3的培养物中含有长春新碱成分,该菌株经鉴定为尖孢镰刀菌FusariumoxysporumSchlecht(图1),97CG3在查氏固体平板培养基上菌丝体纤细,白色,通常带有紫色,该菌可产生2种类型的分生孢子,大型分生孢子呈纺锤形至镰刀型,多胞无色,小型分生孢子单胞无色呈卵形至椭圆形,

并发现有厚垣孢子呈间生和

图1　97CG3显微镜下分生孢子形态(992X)

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所属分类：花卉