首页分享获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物.pdf

获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-05-06 01:56

《获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物.pdf（13页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 101492742 B (45)授权公告日 2011.06.22 CN 101492742 B *CN101492742B* (21)申请号 200910077930.6 (22)申请日 2009.02.04 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12P 19/34(2006.01) (73)专利权人中国科学院植物研究所地址 100093 北京市海淀区香山南辛村 20 号中国科学院植物研究所 (72)发明人舒庆艳张晶晶王亮生 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅任凤华 CN。

2、 101250532 A,2008.08.27, 全文 . 孙坤等 .被子植物系统学中花发育研究的进展及对今后研究的思考 . 植物分类学报 .1998, 第 36 卷 ( 第 6 期 ),558 568. 王宗正章月仙 . 从芍药的花芽分化试论芍药、牡丹的花型形成和演化 .园艺学报 .1991, 第 18 卷 ( 第 2 期 ),163 168. (54) 发明名称获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物 (57) 摘要本发明公开了一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物。本发明提供的获取与牡丹花型性状相关的分子标记的专用引物，包括如下引物对甲。

3、：序列表的序列 1 所示的 DNA 序列和序列表的序列 2 所示的 DNA 序列。本发明提供的方法是应用所述专用引物对待测牡丹基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳带型确定与待测牡丹花型性状相关的分子标记。本发明提供的分子标记可以用于检测牡丹的花型性状，可以提高牡丹选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，为牡丹针对花型的育种提供了一种有效的方法。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员李岚 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 9 页附图 2 页 CN 10149274。

4、2 B1/1 页 2 1. 一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的专用引物，包括引物对甲： SEQ IDNO.1 和 SEQ ID NO.3。 2. 如权利要求 1 所述的专用引物，其特征在于：所述专用引物还包括引物对乙和 / 或引物对丙和 / 或引物对丁；引物对乙： SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.3 ；引物对丙： SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.4。引物对丁： SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.4。 3. 一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法，包括如下步骤： 1) 提取牡丹的基因组 DNA ； 2) 以基因组。

5、 DNA 为模板，利用权利要求 1 或 2 所述的专用引物进行 PCR 扩增； 3) 将 PCR 扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳带型确定与待测牡丹花型性状相关的分子标记。 4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述牡丹的基因组DNA来自牡丹的任何器官；步骤 2) 中，所述 PCR 扩增中，退火温度为 53.5-57.4，循环数个数为 32-36 ；步骤 3) 中，电泳采用 4-6.5的变性聚丙烯酰胺凝胶。 5. 如权利要求 4 所述的方法，其特征在于：步骤 1) 中，所述牡丹的基因组 DNA 来自牡丹的叶片。 6. 一种获取。

6、与牡丹花型性状相关的分子标记的试剂盒，含有权利要求 1 或 2 所述的专用引物。 7. 如权利要求 6 所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括 PCR 反应的常规试剂、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的常规试剂和 Bassam 银染的常规试剂。 8. 如权利要求 7 所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括聚丙烯酰胺、 DNA 聚合酶和 Mg2+离子。 9. 权利要求 1 或 2 所述专用引物在获取与牡丹花型性状相关的分子标记中的应用。权利要求书 CN 101492742 B1/9 页 3 获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物技术领域 0001 本发明涉。

7、及一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物。背景技术 0002 牡丹属于芍药属的木本类群，是中国特有的传统名花，素有 “花王” 之称。传统的杂交育种法周期长，无法早期筛选目标性状，严重限制了培育新品种的速度。分子标记技术能够将标记与植物性状相联系，为牡丹育种提供了一种新手段。利用 DNA 标记辅助选择育种将给传统的杂交育种带来革命性的变化。传统的育种选择是对表型性状的变异进行选择，但有些重要性状(如花色、花型等与观赏品质密切相关的性状)无法在早期检测出来，分子标记技术就可以利用种子以及幼苗进行 DNA 多态性检测，根据与目的基因相关的标记进行选择。

8、，能提高选择的准确度，缩短育种周期，提高育种效率和选择的可靠性，相当简便。 0003 简单重复序列 (simple sequence repeat， SSR) 标记是目前最常用的微卫星标记之一。SSR 标记具有重复性好、多态性高、呈共显性遗传、数量丰富和遍布整个基因组等优点，广泛应用于植物的遗传图谱构建、基因标定、标记辅助育种、品种鉴定、遗传多样性研究方面。为了有效利用牡丹的丰富资源，需要建立牡丹的 SSR 分子标记技术体系，并寻找牡丹的观赏性状与标记的关联。发明内容 0004 本发明涉及获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物。 0005 本发。

9、明提供了获取与牡丹花型性状相关的分子标记的专用引物，包括如下引物对甲：序列表的序列 1 所示的 DNA 序列和序列表的序列 3 所示的 DNA 序列。 0006 所述专用引物还可包括如下引物对乙和 / 或引物对丙和 / 或引物对丁： 0007 引物对乙：序列表的序列 2 所示的 DNA 序列和序列表的序列 3 所示的 DNA 序列； 0008 引物对丙：序列表的序列 1 所示的 DNA 序列和序列表的序列 4 所示的 DNA 序列。 0009 引物对丁：序列表的序列 2 所示的 DNA 序列和序列表的序列 4 所示的 DNA 序列。 0010 本发明提供的获取与牡丹花型。

10、性状相关的分子标记的方法，可包括如下步骤： 0011 1) 提取牡丹的基因组 DNA ； 0012 2) 以基因组 DNA 为模板，利用所述专用引物进行 PCR 扩增； 0013 3) 将 PCR 扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳带型确定与待测牡丹花型性状相关的分子标记。 0014 步骤1)中，所述牡丹的基因组DNA可来自牡丹的任何器官，优选来自叶片，最优选来自幼嫩叶片。 0015 步骤 2) 中，所述 PCR 扩增中，退火温度为 53.5-57.4，循环数个数为 32-36。 0016 步骤 3) 中，电泳采用 4-6.5的变性聚丙烯酰胺凝胶。4-6.。

11、5指的是凝胶浓度 T( )，即凝胶溶液中单体丙烯酰胺和交联剂 N， N - 亚甲基双丙烯酰胺的总质量浓度。 0017 应用所述方法得到的分子标记也属于本发明的保护范围。说明书 CN 101492742 B2/9 页 4 0018 本发明还保护一种获取与牡丹花型性状相关的分子标记的试剂盒，含有所述专用引物。 0019 所述试剂盒还包括 PCR 反应的常规试剂、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的常规试剂和银染的常规试剂；所述试剂盒优选包括聚丙烯酰胺、 DNA 聚合酶和 Mg2+离子。 0020 所述专用引物或所述试剂盒在获取与牡丹花型性状相关的分子标记中的应用也属于本发明的保护范围。。

12、0021 应用本发明的专用引物对牡丹基因组进行 PCR 扩增，得到的电泳图带型清晰且具有多态性，在该位点得到 11 个等位基因。使用单因素方差分析和相关分析，与牡丹花型有关的B类基因的第7个等位基因(375bp处)和花型关联。单因素方差分析中P0.027(显著性水平小于0.05)。相关分析中的相关系数是0.296， P0.027(显著性水平小于0.05)。本发明提供的分子标记可以用于检测牡丹的花型性状，可以提高牡丹选择育种的准确性和效率，缩短育种周期，为牡丹针对花型的育种提供了一种有效的方法。 0022 本发明通过一系列的优化步骤建立了牡丹的 SSR 分子标记技术体系。

13、，获得了一个花型性状和标记的关联，为牡丹花型的育种提供了一种有效的方法，并且为牡丹连锁遗传图谱构建、基因标定、品种鉴定、分子标记辅助育种奠定了技术基础。附图说明 0023 图 1 为 1琼脂糖凝胶电泳图 a。牡丹样本从左至右依次是：卵叶牡丹、黄牡丹、紫牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹、狭叶牡丹、凤丹、大花黄牡丹、皇嘉门、太阳、岛锦、海黄、金阁、白王狮子、芳纪、金岛、寒桜狮子、初乌、红冠玉配、中川粉、花和尚、火焰、藕断丝连、喜庆、大瓣粉、轻罗、凤丹、垫单 2 、垫重 3 ； M 是 100bp plus DNA ladder m。

14、arker，从上到下依次为5000bp、 3000bp、 2000bp、 1500bp、 1000bp、 900bp、 800bp、 700bp、 600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 100bp，购自北京全式金生物技术有限公司。 0024 图 2 为 1琼脂糖凝胶电泳图 b。牡丹样本从左至右依次是：彭州太平红、胭脂图、雪莲、黑花魁、琉璃贯珠、小叶紫、冠世墨玉、湖蓝、富贵红、青龙戏桃花、蓝月、秀群芳、红荷、水晶白、古城春色、少女裙、青龙镇宝、黄丽、葵花红、丝绒红、五彩蝶、洛阳红、首案红、豆绿、姚黄、。

15、二乔、锦袍红； M 是 100bp plus DNA ladder marker，从上到下依次为5000bp、 3000bp、 2000bp、 1500bp、 1000bp、 900bp、 800bp、 700bp、 600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 100bp，购自北京全式金生物技术有限公司。 0025 图 3 为 1琼脂糖凝胶电泳 - 大花黄牡丹、海黄。牡丹样本从左至右依次是：大花黄牡丹 ( 引物对丙 )、海黄 ( 引物对丁 ) ； M 是 100bp plus DNA ladder marker，购自北京全式金生物技术有限公司。。

16、0026 图 4 为 1琼脂糖凝胶电泳 - 黄牡丹、藕断丝连。牡丹样本从左至右依次是：黄牡丹 ( 引物对乙 )、黄牡丹 ( 所用引物对丁 )、藕断丝连 ( 引物对乙 )、藕断丝连 ( 引物对丁 ) ； M 是 100bp plus DNA ladder marker，购自北京全式金生物技术有限公司。 0027 图 5 为 56 个牡丹样本的电泳图。牡丹样本从左至右依次是：葵花红、黄丽、青龙镇宝、少女裙、古城春色、水晶白、红荷、秀群芳、蓝月、青龙戏桃花、说明书 CN 101492742 B3/9 页 5 富贵红、湖蓝、锦袍红、二乔、姚黄、豆绿。

17、、首案红、洛阳红、五彩蝶、丝绒红、冠世墨玉、小叶紫、琉璃贯珠、黑花魁、雪莲、胭脂图、彭州太平红、垫重 3 号、垫单 2 号、凤丹、轻罗、大瓣粉、喜庆、藕断丝连、火焰、花和尚、中川粉、红冠玉配、初乌、寒桜狮子、金岛、芳纪、白王狮子、金阁、海黄、岛锦、太阳、皇嘉门、大花黄牡丹、杨山牡丹、狭叶牡丹、紫斑牡丹、矮牡丹、紫牡丹、黄牡丹、卵叶牡丹； M 是 pBR322 DNA/Msp1 marker(DNA 片段从上到下依次是 622bp， 527bp， 404bp， 309bp， 242bp， 238bp，。

18、217bp， 201bp， 190bp， 180bp， 160bp， 147bp， 123bp， 110bp， 90bp， 76bp， 67bp， 34bp， 26bp)，购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司。具体实施方式 0028 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 0029 56 个牡丹样本为：葵花红、黄丽、青龙镇宝、少女裙、古城春色、水晶白、红荷、秀群芳、蓝月、青龙戏桃花、富贵红、湖蓝、锦袍红。

19、、二乔、姚黄、豆绿、首案红、洛阳红、五彩蝶、丝绒红、冠世墨玉、小叶紫、琉璃贯珠、黑花魁、雪莲、胭脂图、彭州太平红、垫重 3 号、垫单 2 号、凤丹、轻罗、大瓣粉、喜庆、藕断丝连、火焰、花和尚、中川粉、红冠玉配、初乌、寒桜狮子、金岛、芳纪、白王狮子、金阁、海黄、岛锦、太阳、皇嘉门、大花黄牡丹、杨山牡丹、狭叶牡丹、紫斑牡丹、矮牡丹、紫牡丹、黄牡丹、卵叶牡丹。 0030 以上材料来自中国科学院植物研究所，以上牡丹种或品种在中国牡丹品种图志 ( 王莲英主编，中国林业出版社出版， 1997) 或中国。

20、牡丹品种图志 ( 西北、西南、江南卷 ) ( 李嘉珏主编，中国林业出版社出版， 2005) 中均有记载。 0031 实施例 1、与牡丹花型性状相关的 SSR 标记的获得 0032 一、候选引物的设计 0033 本发明人所在实验室根据牡丹的 B 类 MAD-box 基因的 DNA 序列开发了如下引物： 0034 正向引物 1( 序列表的序列 1) ： CAAGAAGGTCAACAATAAAC ； 0035 正向引物 2( 序列表的序列 2) ： CAAGGAGGTCAACAATAAAC ； 0036 反向引物 1( 序列表的序列 3) ： CACAGAAGCCTCCATATTTT ；。

21、 0037 反向引物 2( 序列表的序列 4) ： CACAGAAGCCTCCATTTTTT。 0038 以上四条引物共有四种组合，所以定义四组引物对如下：引物对甲：正向引物 1 和反向引物 1 ；引物对乙：正向引物 2 和反向引物 1 ；引物对丙：正向引物 1 和反向引物 2 ；引物对丁：正向引物 2 和反向引物 2。 0039 二、引物对的筛选 0040 在植株生长旺盛期将幼嫩叶片采下，自来水冲洗干净，拭干备用提取总 DNA。按照 Xiaoyan Han et al.(Biochem.Genet.2008， 46 ： 162-179) 中的方法提取牡丹。

22、嫩叶中的总 DNA。 0041 使用引物对甲扩增 56 个牡丹样本 0042 PCR 反应体系 (20L) ： 3L DNA 模板 (10-50ng)、 1L 正向引物 (10uM)、 1L 反说明书 CN 101492742 B4/9 页 6 向引物(10uM)、 10L 2Easy Taq PCR SuperMix(不含染料)(购自北京全式金生物技术有限公司 )、 5.0L ddH2O。 0043 PCR 的反应程序： 94进行 5min， 94进行 30s， 55.4进行 30s， 72进行 1min，共 35 个循环； 72进行 10min ； 12终止反应。 0044 。

23、将 PCR 产物进行 1琼脂糖凝胶电泳。结果见图 1 和图 2。黄牡丹、大花黄牡丹、海黄、藕断丝连扩增结果不理想，其它 52 个样本都有比较理想的扩增产物。 0045 使用其它引物对扩增牡丹样本 0046 对步骤中不能扩增出产物的牡丹样本，分别选择引物对乙、引物对丙、引物对丁进行扩增，反应体系同步骤，反应程序同步骤。 0047 将 PCR 产物进行 1琼脂糖凝胶电泳。结果见图 3 和图 4。大花黄牡丹用引物对丙，海黄用引物对丁，黄牡丹用引物对乙或引物对丁，藕断丝连用引物对乙或引物对丁可以扩增出理想的产物。 0048 三、牡丹花型与标记的关联 0049 在植株生。

24、长旺盛期将幼嫩叶片采下，自来水冲洗干净，拭干备用提取总 DNA。按照 Xiaoyan Han et al.(Biochem.Genet.2008， 46 ： 162-179) 中的方法提取牡丹嫩叶中的总 DNA。 0050 56个牡丹样本进行PCR扩增，反应体系同步骤二的，反应程序同步骤二的。其中，黄牡丹、海黄和藕断丝连在 PCR 扩增时所用的引物对为引物对丁；大花黄牡丹在 PCR 扩增时所用的引物对为引物对丙；其余 52 个样本在 PCR 时所用引物对是引物对甲。 0051 扩增产物使用 Bassam 银染法进行染色，具体步骤如下： 0052 将附着胶的长板放。

25、入固定液中，摇床上摇 40min ； 0053 蒸馏水洗涤胶 2-3 次，每次 2min，然后竖起控水 15s ； 0054 将胶板放入染色液中染色 30min ； 0055 将染色后的胶板放入蒸馏水中洗 2-3s，迅速捞出控水； 0056 放入显影液中，充分摇动，约 3min 后会出现带； 0057 捞出胶板放入终止液中， 10min 后取出； 0058 放到蒸馏水中清洗，捞出胶板自然晾干。 0059 固定液 ( 也是终止液 ) 配方： 200ml 的冰乙酸加到 1.8L 蒸馏水中，混匀。 0060 染色液配方： 2g 硝酸银溶于 2L 蒸馏水中，用时加入 37甲。

26、醛 3ml，现用现配。 0061 显影液配方： 160g十水碳酸钠(或60g无水碳酸钠)溶于2L蒸馏水中，提前配制，放入 -20冰箱待用。临用前加入 3ml 的 37甲醛和 400ul 的 10mg/ml 硫代硫酸钠 ( 现用现配 )。 0062 实验药品来源：冰乙酸购自北京化工厂， 37甲醛购自北京益利精细化学品有限公司，无水硫酸钠和硫代硫酸钠购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。 0063 附着在玻板上的胶晾干后，将胶板放在发出白色灯光的灯箱上，用数码相机拍照，并进行条带的统计。SSR 分子量标记选用 pBR322 DNA/MspI。 0064 共计出现 11 个等。

27、位基因。首先将质量性状数量化，依据传统的经典分类法，本实验中的56个牡丹样本分别属于8个花型，根据花型从简单到复杂的等级，分别赋值，见表1。然后根据带型的有无，将 56 个样本划分到组 1，组 0。第 7 个等位基因 (375bp 条带 ) 的分说明书 CN 101492742 B5/9 页 7 析数据见表2，将表2的数据输入SPSS中，进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和相关分析 (Bivariate)。 0065 表 1 牡丹花型赋值 0066 花型赋值单瓣型 1 荷花型 2 菊花型 3 蔷薇型 4 托桂型 5 皇冠型 6 绣球型 7 台阁型。

28、 8 0067 表 2 用于 SPSS 分析的数据说明书 CN 101492742 B6/9 页 8 0068 说明书 CN 101492742 B7/9 页 9 0069 0070 结果表明，该位点的第 7 个等位基因 (375bp 条带 ) 与花型相关联，单因素方差分析中 P 0.027( 显著性水平小于 0.05)。相关分析中的相关系数是 0.296， P 0.027( 显著性水平小于 0.05)。 0071 实施例 2、参数的优化 0072 以冠世墨玉为供试材料，进行参数的优化。 0073 一、 PCR 条件的优化 0074 1、退火温度的优化 0075 在。

29、植株生长旺盛期将幼嫩叶片采下，自来水冲洗干净，拭干备用提取总 DNA。按照 Xiaoyan Han et al.(Biochem.Genet.2008， 46 ： 162-179) 中的方法提取牡丹嫩叶中的总 DNA。 0076 以总 DNA 为模板，用引物对甲进行 PCR。分别选择 4 个退火温度 (52.1、 53.5、 55.4、 57.4 ) 进行退火温度的优化。 0077 PCR 反应体系 (20L) ： 3LDNA 模板 (10-50ng)、 1L 正向引物 (10uM)、 1L 反向引物(10uM)、 10L 2Easy Taq PCR SuperMix(不含染料)(购自。

30、北京全式金生物技术有限公司 )、 5.0L ddH2O。 0078 PCR 的反应程序： 94进行 5min， 94进行 30s，在预定的退火温度下进行 30s， 72进行 1min，共 35 个循环； 72进行 10min ； 12终止反应。 0079 将PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳。上样量是10L(含2L6Loadingbuffer，购自北京全式金生物技术有限公司 )。电压 120V，电泳时间是 45min。电泳缓冲液为 1TAE( 每升 50TAE 中： 242g Tris 碱， 57.1mL 冰醋酸， 100mL0.5M EDTA， pH 值为 8.0)。 0080。

31、结果表明： 55.4是最佳退火温度。 0081 二、胶浓度的筛选说明书 CN 101492742 B8/9 页 10 0082 在植株生长旺盛期将幼嫩叶片采下，自来水冲洗干净，拭干备用提取总 DNA。按照 Xiaoyan Han et al.(Biochem.Genet.2008， 46 ： 162-179) 中的方法提取牡丹嫩叶中的总 DNA。以总 DNA 为模板，用引物对甲进行 PCR。 0083 PCR 反应体系 (20L) ： 3L DNA 模板 (10-50ng)、 1L 正引物 (10uM)、 1L 反引物(10uM)、 10L 2Easy Taq PCR Su。

32、perMix(不含染料)(购自北京全式金生物技术有限公司 )、 5.0L ddH2O。 0084 PCR 的反应程序： 94进行 5min， 94进行 30s， 55.4进行 30s， 72进行 1min，共 35 个循环； 72进行 10min ； 12终止反应。 0085 PCR 产物在 94变性 5min，然后在 4-6.5的变性聚丙烯酰胺凝胶 ( 设置三种聚丙烯酰胺凝胶浓度： 4、 5.5、 6.5 ) 上电泳。上样量 5L( 含 2.5L2 变性凝胶加样缓冲液，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 )。聚丙烯酰胺胶的大小 35cm45cm，厚度是 0.4mm。电。

33、泳条件是 75W 恒功率下预电泳 40min， 1500V 下电泳 1h 30min，电泳缓冲液是 1TBE(5TBE ： 445mM Tris-CL， 445mM 硼酸， 12mM EDTA-Na2( 乙二胺四乙酸二钠，调 pH 值为 8.0)。 0086 结果表明， 4-6.5变性聚丙烯酰胺凝胶均可得到分辨率较高的电泳结果。 0087 序列表 0088 中国科学院植物研究所 0089 获取与牡丹花型性状相关的分子标记的方法及其专用引物 0090 CGGNARY92064 0091 4 0092 1 0093 20 0094 DNA 0095 人工序列 0096 0097 0098 1。

34、 0099 caagaaggtc aacaataaac 20 0100 2 0101 20 0102 DNA 0103 人工序列 0104 0105 0106 2 0107 caaggaggtc aacaataaac 20 0108 3 0109 20 0110 DNA 说明书 CN 101492742 B9/9 页 11 0111 人工序列 0112 0113 0114 3 0115 cacagaagcc tccatatttt 20 0116 4 0117 20 0118 DNA 0119 人工序列 0120 0121 0122 4 0123 cacagaagcc tccatttttt 20 说明书 CN 101492742 B1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 图 4 说明书附图 CN 101492742 B2/2 页 13 图 5 说明书附图。