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一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-05-04 22:06

一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法与流程

本发明涉及冰冻切片的技术领域，尤其涉及一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法。

背景技术：

菠萝蜜：又名波罗蜜，别名苞萝、木菠萝、树菠萝、大树菠萝、蜜冬瓜、牛肚子果，果实肥厚柔软，清甜可口，香味浓郁，故被誉为“热带水果皇后”。是世界著名的热带水果，属桑科桂木属常绿乔木，多生长于赤道附近地区，有淡淡臭味，成熟果肉为黄色，香甜可口，果实结于树干，内藏无数金黄色肉包，果肉中含有糖分、脂肪、蛋白质，味深甜，肥厚柔软，清甜可口，香味浓郁，菠萝蜜果的果实浅黄色，具有止渴、通乳、补中益气功效，菠萝蜜的营养价值很高，与此同时，菠萝蜜还有很高的药用价值。菠萝蜜通常可以分为干浆果(干苞)和多浆果(湿苞)两种。前者果肉厚，果汁少，香甜爽脆；后者果肉湿软，果汁多，味道特别蜜甜。

目前切片方法多为石蜡切片和包埋后的超薄切片，制作过程和步骤都比较费时费力。而冰冻切片法是一种在低温条件下使已固定或新鲜组织块不经脱水和包埋先进行冰冻快速冷却到一定硬度，然后在切片机上切片的一种方法。与常规的石蜡切片相比，冰冻切片具有快速、简便和易操作等优点。在研究菠萝蜜果肉的外表皮细胞、内表皮细胞、果肉基本组织的横截面、外韧维管束、周韧维管束等组织的结构特点时，冰冻切片法有利于进行细胞生物学和分子生物学的研究，并提供了有效地研究手段，便于参考，也可对比健康菠萝蜜组织和菠萝蜜的患病组织中的显微结构差异。现有技术有对菠萝蜜叶和花的结构进行了研究，而果实的结构研究却少有报道，由于菠萝蜜果肉细胞结构的特殊性，冰冻切片技术在菠萝蜜果肉的研究中鲜有报道。菠萝蜜果肉含水分较多，一般的冰冻切片时易出现冰晶，导致细胞破碎结构不完整，甚至无法观察到整片果肉组织的形态。基于上述菠萝蜜果肉冰冻切片中存在的问题，提出了一种冰冻切片方法，具有快速、简便、易操作、能够观察到完整细胞结构和减少冰晶损伤的出现，获得质量较优的切片结果。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法，解决了上述问题。

本发明采用的技术手段如下：一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜的菠萝蜜果肉切成小块，并将小块果肉组织置于含有浓度为18～23％的蔗糖的faa固定液中处理25～35min，再将固定处理后的果肉组织用含有浓度为18～23％的蔗糖的磷酸缓冲液浸洗20～30min；

(2)将浸洗后的果肉组织置于甘油中，并真空抽气40～60min；

(3)将真空抽气后的果肉组织置于培养箱中培养，再利用蔗糖溶液和otc的混合包埋剂进行包埋20～40min；

(4)将包埋好的果肉组织置于液氮中速冻35～45s；

(5)将速冻好的果肉组织置于冷冻箱中回温0.8～1.2h，再进行切片；

(6)向切片材料滴加番红水溶液染色，再将切片浸泡在蒸馏水中5～10s，洗涤材料2～3次，滴加180～220ul吐温-20于切片材料表面，加盖玻片。

进一步的，所述步骤(1)中，磷酸缓冲液的浓度为8～12mmol/l。

进一步的，所述步骤(2)中，将浸洗后的果肉组织置于浓度为10～20％的甘油中，并真空抽气40～60min。

进一步的，所述步骤(2)中，将浸洗后的果肉组织置于浓度为15％的甘油中，并真空抽气50min。

进一步的，所述步骤(3)中，培养温度为20～25℃，培养时间为1～1.5h。

进一步的，所述步骤(3)中，蔗糖溶液与oct包埋剂按照体积比为0.8～1.2：0.8～1.2的比例进行混合。

进一步的，所述步骤(4)中，速冻温度为-190～-210℃。

进一步的，所述步骤(5)中，切片温度为-18～-21℃，切片厚度为7～12μm。

进一步的，所述步骤(6)中，向切片材料滴加0.5～1.5％番红水溶液染色32～40min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

首先，利用蔗糖-faa固定液固定处理菠萝蜜果肉，蔗糖作为保护剂减轻了菠萝蜜果肉的冷冻伤害，提供冷冻保护；而faa固定液是为了更好使样品组织保持在取样时的生理状态，利用蔗糖的磷酸缓冲液浸洗是对固定的样品组织进行渗透保护。

其次，置于甘油中，并在一定时间下真空抽气，由于菠萝蜜果肉的组织特点，菠萝蜜果肉中的水分较其他植物器官的水分多，在一定时间下抽真空是为了使菠萝蜜果肉的空腔完全被甘油所填充，让菠萝蜜的细胞间充满甘油，从而更好地替换细胞中的水分，抽真空的时间不够会导致样品组织的破碎。

再次，由于菠萝蜜的果肉组织对比其它花器官、茎段和叶片等植物器官含有更多的水分，经培养箱培养后利用混合包埋剂共同处理菠萝蜜果肉样品，培养箱的目的是为了让组织中的甘油充分渗透到样品组织中并稳定样品组织状态，包埋剂能够充分包埋到样品的组织，对样品的冷冻保护性更好，而包埋时间不够会导致样品组织的破碎。

然后，将包埋好的样品置于液氮中速冻，为了减少样品在最低冰晶带的停留时间，减少冰晶的产生。

而后，将速冻好的样品置于冷冻箱中回温，切片，回温是为了使样品适量软化，避免样品速冻后过硬造成组织破碎。

最后，进行染色，由于菠萝蜜果肉含水量较高，所以样品经速冻染色后用蒸馏水冲洗容易导致组织碎裂后被冲走，因此不可用水冲洗脱去浮色，只能用蒸馏水浸泡后脱色。

该发明各个步骤紧密联系，相互协同作用，对现有的冰冻切片法操作步骤进行了优化，减少了实验步骤和节省实验时间，减少了菠萝蜜果肉细胞冰晶的产生，减少细胞的破碎，保证了细胞结构和组织结构的完整性，能够获得清晰的果肉组织切片图。

附图说明

图1为速冻未包埋的菠萝蜜果肉组织；

图2为未速冻后包埋的菠萝蜜果肉组织；

图3为速冻包埋的健康组织菠萝蜜果肉组织；

图4为速冻包埋的患病组织菠萝蜜果肉组织。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

18～23％蔗糖溶液：取18～23g的蔗糖固体和100ml的ddh2o混合。

faa固定液：福尔马林(40％甲醛)5ml，冰醋酸5ml，95％酒精50ml，蒸馏水35ml，混匀。

磷酸缓冲液：pbs，8～12mmol/l，ph7.0。

含18～23％蔗糖的faa固定液：取18～23ml的蔗糖固体和100ml的faa固定液混合。

含18～23％蔗糖的磷酸缓冲液：取18～23ml的蔗糖固体和100ml的磷酸缓冲液混合。

10～20％的甘油：取10～20ml的100％甘油和100ml的ddh2o混合。

18～23％蔗糖溶液与oct的混合包埋剂：将18～23％的蔗糖溶液与oct包埋剂按照v/v＝0.8～1.2：0.8～1.2的比例进行混合。

实施例1

一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜的菠萝蜜果肉切成小块，并将小块果肉组织置于含有浓度为18％的蔗糖的faa固定液中处理25min，再将固定处理后的果肉组织用含有浓度为18％的蔗糖的磷酸缓冲液浸洗20min，磷酸缓冲液的浓度为8mmol/l。

(2)将浸洗后的果肉组织置于浓度为10％甘油中，并真空抽气15min。

(3)将真空抽气后的果肉组织置于培养箱中培养2h，培养温度20℃，再利用蔗糖溶液和otc的混合包埋剂按照体积比为0.8：1.2的比例进行包埋20min。

(4)将包埋好的果肉组织置于液氮中速冻35s，速冻温度为-190℃。

(5)将速冻好的果肉组织置于冷冻箱中回温0.8～1.2h，再进行切片，切片温度为-18℃，切片厚度为7μm；

(6)向切片材料滴加0.5％番红水溶液染色32min，再将切片浸泡在蒸馏水中5s，洗涤材料2次，滴加180ul吐温-20于切片材料表面，加盖玻片。

实施例2

一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜的菠萝蜜果肉切成小块，并将小块果肉组织置于含有浓度为23％的蔗糖的faa固定液中处理35min，再将固定处理后的果肉组织用含有浓度为18～23％的蔗糖的磷酸缓冲液浸洗30min，磷酸缓冲液的浓度为12mmol/l。

(2)将浸洗后的果肉组织置于浓度为20％甘油中，并真空抽气25min。

(3)将真空抽气后的果肉组织置于培养箱中培养4h，培养温度25℃，再利用蔗糖溶液和otc的混合包埋剂按照体积比为1.2：0.8的比例进行包埋40min。

(4)将包埋好的果肉组织置于液氮中速冻45s，速冻温度为-210℃。

(5)将速冻好的果肉组织置于冷冻箱中回温1.2h，再进行切片，切片温度为-21℃，切片厚度为12μm；

(6)向切片材料滴加1.5％番红水溶液染色40min，再将切片浸泡在蒸馏水中10s，洗涤材料3次，滴加220ul吐温-20于切片材料表面，加盖玻片。

实施例3

一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜的菠萝蜜果肉切成小块，并将小块果肉组织置于含有浓度为20％的蔗糖的faa固定液中处理30min，再将固定处理后的果肉组织用含有浓度为20％的蔗糖的磷酸缓冲液浸洗15min，磷酸缓冲液的浓度为10mmol/l。

(2)将浸洗后的果肉组织置于浓度为15％甘油中，并真空抽气50min。

(3)将真空抽气后的果肉组织置于培养箱中培养3h，培养温度22℃，再利用蔗糖溶液和otc的混合包埋剂按照体积比为1：1的比例进行包埋30min。

(4)将包埋好的果肉组织置于液氮中速冻40s，速冻温度为-200℃。

(5)将速冻好的果肉组织置于冷冻箱中回温1h，再进行切片，切片温度为-20℃，切片厚度为10μm；

(6)向切片材料滴加1.0％番红水溶液染色35min，再将切片浸泡在蒸馏水中8s，洗涤材料3次，滴加200ul吐温-20于切片材料表面，加盖玻片。

为了验证本发明的有益效果，进一步进行以下验证试验：

设置对比例

对比例1

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(1)采用浓度为15％的蔗糖的faa固定液中处理20min，用含有浓度为15％的蔗糖的磷酸缓冲液浸洗20min。

对比例2

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(1)采用浓度为15％的蔗糖的pbs固定液中处理30min，用含有浓度为15％的蔗糖的磷酸缓冲液浸洗18min。

对比例3

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(1)采用4％多聚甲醛、2.5％戊二醛、10mmol/lpbs固定液处理30min，用含有浓度为20％的蔗糖的磷酸缓冲液浸洗20min。

对比例4

该对比例与实施例3的区别在于：未进行步骤(2)，未将浸洗后的果肉组织置于甘油中，也并未进行真空抽气。

对比例5

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(3)未将果肉组织进行培养，直接将真空抽气后的果肉组织利用蔗糖溶液和otc的混合包埋剂按照体积比为1.5：2的比例进行包埋。

对比例6

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(3)未将果肉组织进行培养，直接将真空抽气后的果肉组织利用otc包埋剂按照体积比为1：1的比例进行包埋。

对比例7

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(3)未将果肉组织进行培养，直接将真空抽气后的果肉组织利用普通胶水按照体积比为1.5：2的比例进行包埋。

对比例8

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(4)将包埋好的果肉组织置于液氮中速冻20s。

对比例9

该对比例与实施例3的区别在于：先将包埋好的果肉组织置于液氮中速冻30s，再利用普通胶水按照体积比为1.5：2的比例进行包埋。

对比例10

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(4)将包埋好的果肉组织置于液氮中速冻48s。

对比例11

该对比例与实施例3的区别在于：步骤(6)向切片材料滴加1.0％番红水溶液染色30min，再将切片用蒸馏水洗涤材料4次，滴加50％甘油于切片材料表面，加盖玻片。

一、将本发明方法与石蜡切片制作方法的时间周期进行比较，结果见表1。

现有石蜡切片法：取新鲜的菠萝蜜果肉切成小块，并将小块果肉组织置于faa固定液中处理，再将固定处理后的果肉组织充分水洗，用梯度酒精作为脱水剂逐级脱水，二甲苯作为透明剂浸渍，利用石蜡浸入组织内后包埋，再进行切片、展片、染色等步骤。

表1：

由上表可知，本发明采用的菠萝蜜果肉冰冻切片法与石蜡切片法相比，本发明所用的总时间为5.7h～6.2h，而石蜡切片法所用的总时间为7～8d，本发明具有减少实验步骤和节省实验时间的作用，进一步表明，冰冻切片法便于对菠萝蜜果肉进行进一步的结构分析，通过显微结构，能够观察到果肉细胞完整结构及排列情况。

二、将本发明实施例1～3的方法与对比例1～11的方法进行切片的完整性，细胞的碎裂程度以及切片效果，结果见表2。

表2：

由上表可知，实施例3与对比例1～3比较，由于菠萝蜜的组织结构特点，本发明果肉在特定浓度的蔗糖-faa固定液、蔗糖的磷酸缓冲液处理一定时间，具有切片完整度高，菠萝蜜果肉细胞完整度好，冰晶量少，样品组织显微观察效果优的优势。

实施例3与对比例4比较，由于菠萝蜜果肉的组织特点，果肉样品的冷冻切片难度要大于植物其他器官组织。菠萝蜜果肉中水分较多，因此对比其他植物器官，甘油抽真空置换样品组织中的水分需要在一定的时间内进行，否则会导致样品组织的破碎。

实施例3与对比例5～7比较，由于菠萝蜜的果肉组织对花器官、茎段和叶片等植物器官含有更多的水分。所以本发明在包埋时先进行培养，目的是为了让组织中的甘油充分渗透到样品组织中并稳定样品组织状态，再使用包埋剂是oct和20％的蔗糖按体积比混合的溶剂，对比纯oct包埋剂对样品的冷冻保护性更好，也比普通胶水的冷冻保护性更好。

实施例3与对比例8～10比较，本发明先进行混合包埋剂包埋后再进行液氮速冻，为冷冻切片过程中的样品提供冷冻保护，防止样品组织破碎。

实施例3与对比例11比较，由于菠萝蜜果肉含水量较高，所以样品经速冻染色后用蒸馏水冲洗容易导致组织碎裂后被冲走，因此不可用水冲洗脱去浮色，只能用蒸馏水浸泡后脱色。

对比未抽真空处理、未包埋、速冻(图1)，未抽真空、包埋、未速冻(图2)，本发明减少了菠萝蜜果肉细胞冰晶的产生，减少细胞的破碎，保证了细胞结构和组织结构的完整性，能够获得清晰的果肉组织切片图(图3)。图1、2中的组织分别为周韧维管束，以及菠萝蜜的果肉细胞。图3中的组织为健康菠萝蜜组织中的周韧维管束，以及维管束周边的果肉细胞。图4中为菠萝蜜的果肉细胞，以及果肉患病组织的细胞结构。

综上，本发明的一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法，包括利用蔗糖-faa固定液固定处理菠萝蜜果肉，再利用蔗糖的磷酸缓冲液浸洗是对固定的样品组织进行渗透保护。置于甘油中，并真空抽气，经培养箱培养后利用混合包埋剂共同处理菠萝蜜果肉样品，将包埋好的样品置于液氮中速冻，将速冻好的样品置于冷冻箱中回温，切片，最后进行蒸馏水浸泡后洗涤。该发明各个步骤紧密联系，相互协同作用，对现有的冰冻切片法操作步骤进行了优化，减少了实验步骤和节省实验时间。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。