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胶膜菌属真菌菌株及其在促进硬叶兰种子萌发中的应用的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-05-01 20:24

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胶膜菌属真菌菌株及其在促进硬叶兰种子萌发中的应用的制作方法
一种胶膜菌属(Tulasnella)真菌菌株(CGMCC?),其ITS序列已提交美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI,/),其Genbank号为:。本发明的胶膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC?)通过与原球茎形成共生关系,促进硬叶兰种子萌发并长成幼苗。实验证实,接种从硬叶兰原球茎中分离到的CGMCC?%±16%。
【专利说明】胶膜菌属真菌菌株及其在促进硬叶兰种子萌发中的应用【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】,涉及一种能与硬叶兰(Cymbidiummannii)原球茎共生形成共生关系并促进种子萌发成原球茎进而长成幼苗的有效真菌菌株胶膜菌(Tulasnella)菌株(),及其在促进硬叶兰种子萌发上的应用,具体来说涉及一种能与硬叶兰原球茎形成共生关系并促进其种子萌发生长至幼苗阶段的有效真菌。
【背景技术】
[0002]兰科植物的种子非常细小,仅有发育不完全的胚,在
自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质。兰科植物种子的萌发可以通过非共生萌发培养和共生萌发培养两种方式。目前兰科植物种子的萌发,多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发,萌发率虽高,但在进行濒危种类野外回归时,非共生萌发(无菌萌发)幼苗移植到自然环境中生长缓慢,抗病原微生物能力差,存活率较低,并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受阻。而通过种子和真菌的共生萌发获得的幼苗在回归到自然生境后具有较好的环境适应性。因此获得种子萌发的有效共生真菌是进行珍稀濒危兰科植物保护的第一步。利用种子迁地共生萌发技术诱导种子萌发成原球茎,分离原球茎中的共生真菌是获取促进种子萌发有效菌株最直接最高效的方法。共生萌发培养技术是指在特定的基质(培养基)中同时播种植物种子和共生真菌,该方法可以提高种子的萌发率、幼苗的生长速度以及移植到自然环境后的幼苗存活率。由于兰科植物种子与真菌的共生关系具有专一性,不同兰科植物种子的共生真菌不同,确定能与硬叶兰种子形成共生关系并促进其萌发的有效真菌是培育硬叶兰幼苗的关键环节,是开展硬叶兰原生境回归工作的基础。将硬叶兰种子和分离得到的真菌在人工培养基上进行共生萌发实验,筛选出能促进硬叶兰种子萌发至幼苗的有效共生真菌,可为高效生产菌根化幼苗提供必要条件,为开展硬叶兰的回归奠定基础。目前,现有技术中未见有胶膜菌
(Tulasnella)菌株()及其在促进硬叶兰种子萌发生长成幼苗生长方面的用途和方法的报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供胶膜菌(Tulasnella)菌株()及其在促进硬叶兰种子萌发生长成幼苗方面的用途和方法。本发明的菌株通过共生萌发实验将硬叶兰种子和不同的真菌及对照分别在燕麦培养基上培养,通过种子萌发率的比较,成功的获得促进硬叶兰种子萌发的有效菌株,从而为利用硬叶兰种子和真菌共生萌发来高效培育种苗开辟了一条新的途径。
[0004]为了实现本发明的上述目的,本发明提供了如下的技术方案:
[0005]一种胶膜菌属(Tulasnella)真菌菌株()。
[0006]如所述的菌株(),该菌株()的nrDNAITS序列提交美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI,/),。[0007]如所述的胶膜菌(Tulasnella)菌株(),所述菌株()的生物学特征为:菌株在PDA平板上培养7天其菌落白色,气生菌丝发达,圆周状发散生长,略显稀疏。光学显微镜下观察,菌丝具隔膜,粗
-,,分枝处缢缩,距分枝不远处形成隔膜;老菌丝细胞壁加厚现象明显;培养2周后形成串珠状的厚垣孢子。
[0008]所述的胶膜菌(Tulasnella)菌株()在促进硬叶兰种子萌发上的应用。
[0009]如所述的应用,胶膜菌(Tulasnella)菌株()通过与原球茎形成共生关系,促进硬叶兰种子萌发并长成幼苗。
[0010]如所述的应用,通过将硬叶兰种子与不同种类的真菌共同培养于燕麦培养基,在人工培养箱内25±2°c条件下分别在有光条件(光周期为12/12hL/D)和黑暗条件(光周期为0/24hL/D)下培养,使菌株与原球茎形成共生关系,从而促进硬叶兰种子萌发并长成幼苗。
[0011]所述的胶膜菌(Tulasnella)菌株()促进硬叶兰种子萌发的方法,其特征在于将胶膜菌(Tulasnella)菌株()与原球茎形成共生关系,促进硬叶兰种子萌发并长成幼苗。
[0012]如所述的方法,通过将硬叶兰种子与不同种类的真菌共同培养于燕麦培养基,在人工培养箱内25±2°C条件下分别在有光条件(光周期为12/12hL/D)和黑暗条件(光周期为0/24hL/D)下培养,使菌株与原球茎形成共生关系,从而促进硬叶兰种子萌发并长成幼苗。
[0013]为了实现本发明的目的,本发明提供的具体步骤为:
[0014]1、本发明菌种于2013年04月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保存编号:。本发明菌株的ITS序列已提交美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI,/),其Genbank号为:。
[0015]2、,气生菌丝发达,圆周状发散生长,略显稀疏。光学显微镜下观察,菌丝具隔膜,粗
-,,分枝处缢缩,距分枝不远处形成隔膜;老菌丝细胞壁加厚现象明显;培养2周具串珠状的厚垣孢子。
[0016]3、对本发明的硬叶兰种子萌发有效共生真菌ITS片段序列在美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI,/)中进行BLAST比对分析,其与⑶%。根据菌落、显微形态特征及分子生物学手段将本发明所涉及真菌鉴定为胶膜菌属(Tulasnella)真菌。
[0017]4、硬叶兰种子与胶膜菌属真菌共生萌发实验
[0018]利用种子与真菌在培养基内的共生萌发实验来检测分离到的真菌是否对种子萌发阶段有促进效果以及对比不同真菌对种子萌发阶段促进效果的差异。
[0019]°C试管斜面内的供试菌株取出,重新接种在PDA平板培养基上,置于人工气候箱内25±2°C培养,进行活化。待真菌菌丝快长满培养皿时(约10天)取出作为共生萌发材料。
[0020]:所用培养基为燕麦琼脂培养基(0MA,+,ρΗ=-)。将配好的培养基倒在旋口瓶中,旋紧瓶盖,灭菌(121。。,20min)后备用。
[0021]:实验前将储存在_20°C中的种子取出,放在室温下10个小时,使种子温度恢复至室温。将少量种子放在纸质的种子包内,用订书钉将纸袋封好。将装有种子的纸袋浸泡在蒸馏水中5-10分钟,轻轻的挤压出气泡。用镊子将纸袋转移到盛有次氯酸钠溶液(有效氯离子浓度为1%)及含一滴洗涤剂的烧杯中,轻轻搅拌或摇动烧杯。10分钟后,将纸袋移至超净工作台,用无菌镊子将纸袋转移到盛有无菌蒸馏水的烧杯中,轻轻摇动。重复冲洗种子3-4次。轻轻挤压出纸袋内多余的水,用无菌剪刀剪开纸袋,即可获得灭菌种子。[0022]:据文献Dixon(1987)所用的方法稍作修改。将无菌种子与Ig*L_1无菌琼脂溶液制作成无菌种子悬浮液。在OMA培养基表面平行放置两片半径为6cm的半圆形无菌尼龙布(孔径为45μm),用移液枪吸取150μI种子悬浮液均匀播种在每片尼龙布上。在培养基中间接种约
()含有单一真菌纯培养物的琼脂块,用封口膜将培养皿密封好。共分三组:;另外2组设置为对照,其中一组接种从览唇石斛(Dendrobiumaphyllum)原球莖内分离到的胶膜菌属(Tulasnella)真菌(编号为FDaI7);另一组为空白对照组(CK)不接菌。每组重复14个培养皿,在人工培养箱内25±2°C下恒温培养,每组各7个培养皿分别在有光条件(光周期为12/12hL/D)和黑暗条件(光周期为0/24hL/D)下培养。
[0023]:播种后每周检测种子萌发情况,记录种子萌发及形成原球茎的时间。培养数周后当培养皿中产生大量处于发育初期阶段的幼苗时将全部培养皿取出,在立体显微镜下观察记录种子萌发及原球茎发育情况。在文献Stewart&Zettler(2002)对种子萌发和原球茎发育情况的分级标准基础之上稍作调整,对种子萌发情况进行分级统计。统计光照和黑暗条件下接菌不同真菌的促种子萌发效果,对比筛选能显著促进种子萌发并生长成幼苗的有效菌株。
[0024]上述步骤中,步骤I按照菌种保藏单位的要求提供三支试管斜面培养的菌种材料入库获取入册登记编号;同时将测序所得的ITS碱基序列上传至Genbank提供的软件并提交获取
Genbank号。
[0025]步骤2所述观察菌株显微形态特征使用插片培养法,霉菌培养箱在25±2°C条件下培养7至10天,取插片按常规制片方法制片。根据观察需要选择不同生长时期的菌丝进行观察测量如:位于插片底部的菌丝体生长时间较长可见串珠状厚垣孢子,辅助显微镜测微标尺可对菌丝的粗细进行测量。
[0026]步骤3所述的分子鉴定中,采用CTAB法提取真菌DNA,PCR扩增所用引物为ITSl和ITS4;PCR反应体系(25μI)包括:,,+,
,,,,2μIDNA模板。扩增反应在PCR仪PerkinElmer上进行,如下PCR循环:94°C预变性3min,循环I次;94°C变性Imin,5TC退火lmin,72°C延伸lmin,30次循环;最后72°C延伸lOmin。PCR扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序。对所测序列提交美国国立生物技术信息中心数据库进行比对,初步确认其分类学地位。
[0027],所述的培养条件为:光照强度为2000-3000Lx,温度25±2°C,光周期12h/12hL/D。
[0028]&Zettler(2002)的方法对种子萌发和原球茎发育情况进行分级,分为
5个阶段:阶段O描述为种胚透明,种皮完好,种子未萌发;阶段I描述为种胚吸水膨胀;阶段2描述为种胚继续膨大,突破种皮,视为萌发;阶段3描述为出现原生分生组织,即形成原球茎;阶段4描述为长出第一片叶片;阶段5描述为第一片叶片继续生长,变长。
[0029]所述的培养数周要根据种子萌发情况确定,本项发明中选择8至10周,因种子大部分已萌发且有些已达到幼苗阶段。
[0030]参考文献为:,orchidclubofsouthAustralia:1nc.,Adelaide.;McKendrickSL,LeakeJR,TaylorDL,-heterotrophicplantsinnature::523-537.;StewartSL,-aquaticreinorchids(Habenariarepens,H-quinquiseta,H-macroceratitis):25-35.。
[0031]与现有技术相比,本发明具备如下显著优益性:
[0032]兰科植物种子的萌发可以通过非共生萌发培养和共生萌发培养两种方式。虽然大多数兰科植物可通过非共生萌发培养,且具有较高的萌发率,但是此方式获得的幼苗移植到自然界中,生长缓慢,