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Plant Physiol Bioch｜外源激素调控桑葚黄酮生物合成机制解析

来源：花匠小妙招时间：2025-04-21 01:25

外源激素处理下红果2号桑椹黄酮生物合成机制的代谢组学和转录组学分析

期刊：Plant Physiology and Biochemistry

IF：6.5

发表时间：2024年5月

研究背景

2024年5月，西北农林科技大学钱永华教授团队在杂志Plant Physiology and Biochemistry上在线发表了题为“Metabolomic and transcriptomic analysis of flavonoids biosynthesis mechanisms in mulberry fruit (Hongguo 2) under exogenous hormone treatments”的研究论文，整合转录组和代谢组分析，揭示了外源IAA（吲哚乙酸）、SPM（精胺）和ETH（乙烯）处理下桑椹果实黄酮生物合成机制。

桑树因其丰富的多酚、多糖等提取物以及丰富的色彩在中国得到了广泛的认可。水果成熟过程中的着色、TCA循环微调、淀粉水解、增加甜味等过程有助于水果各种口味的形成。ETH是水果成熟过程中最重要的参与者之一，可以通过上调桃子中和的表达来引起花青素的积累。多胺是一种ETH拮抗剂，可抑制内源性ETH合成，延缓桃果实成熟和衰老。IAA能促进种子颜色、耐盐性、种子水分吸收和导电性，也可以通过编码ACC合酶基因的表达来影响ETH的生物合成。由此可见激素在果实的生长发育中起着重要作用，但桑椹果实发育过程中激素调控的具体生理变化和分子机制仍然有待进一步探索。迈维代谢为该研究提供了转录组和黄酮代谢组检测服务！

取样细则

以陕西省38年生红果2号桑树为试材，在盛花后15d，选取相同生长状态的健康桑椹果实进行试验。将100mg/L IAA、100mg/L ETH、20mg/L SPM溶液均匀喷洒在果实表面，以无菌水为对照，每天进行处理，在盛花后第21、23、25、27、29天采集果实。每个处理有三个生物重复，以一棵树上的10个分枝作为一个生物重复。将取好的桑椹果实在液氮中冷冻，保存在-80°C冰箱。

研究思路

研究结果

1、外源性激素对桑椹生理变化的影响

从完全开花后的第27天开始观察到颜色增强过程，并受到外源ETH和IAA的显著影响，在29天花青素分别积累了134.49 mg/g和102.71 mg/g。SPM处理在前4次采样期间变化缓慢，在29天时花青素突然积累了120.76 mg/g（图1B)。

与花青素积累不同，SPM可以快速促进糖积累。处理前桑果含糖量为11.41 mg/g。在23天增加到14.51 mg/g，并保持不变，29天时增加到28.6mg/g（图1C）。27天时，SPM处理下的可滴定酸从0.24%稳步下降到0.05%，这是三种外源性激素处理中变化最显著的（图1D)。与SPM处理相比，ETH处理和IAA处理糖含量变化趋势相似，25天时分别上升到8.84mg/g 和11.11 mg/g，随后分别大幅飙升至32.31 mg/g和35.29mg/g（图1C）。值得注意的是，虽然ETH处理后的酸在27天之前一直保持在0.22%左右，但它对29天的可滴定酸有明显的抑制作用，与SPM相似（图1D）。与ETH和SPM相比，IAA对酸含量的影响较小，在29天时，酸含量恢复到0.21%（图1D）。

另外外源施加ETH、SPM和IAA依次增加了内源性GA3和ABA的含量（图1E和F）。外源性SPM显著抑制了内源性IAA的含量（图1H）。ETH、IAA和SPM均能抑制ZR含量的积累（图1G）。

图1 不同外源激素处理下“红果2”桑椹表型及生理指标变化。

2、IAA、SPM、ETH和水处理桑椹的代谢组学差异

作者选择IAA、SPM、ETH和水处理29天的桑葚，并利用LC-ESI-MS/MS对代谢物进行鉴定，共鉴定出136种黄酮类代谢物，主要包含花青素、黄酮和黄酮醇三类（图2A)。主成分分析（PCA）显示出水处理和激素处理之间的显著差异（图2B）。差异代谢物筛选在water vs ETH，water vs IAA和water vs SPM比较组分别得到42，35和40个差异显著代谢物（SDMs），其中34个为不同比较组共有的（图2C）。SDMs（显著差异代谢物）的KEGG富集分析结果显示，大多数SDMs在类黄酮途径和花青素途径显著富集（图2D-F）。

总的来说，作者鉴定到13种共有的花青素化合物在water vs IAA, water vs SPM 和water vs ETH组中存在显著差异。包括矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，矢车菊素-3-O-半乳糖苷，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，芍药花素-3-O-葡萄糖苷等。还鉴定了四种上游代谢产物：圣草酚、槲皮素、二氢山柰酚和二氢槲皮素，它们的积累在water vs IAA, water vs SPM和water vs ETH组中显著不同，而五羟黄酮仅在water vs SPM中差异积累，木犀草素仅在water vs ETH中差异积累。关于上游代谢产物，作者观察到与SPM和IAA处理组相比，它们在ETH中积累更多。另外该研究结果表明，儿茶素，表儿茶素和各种类型的原花青素在外源激素处理后积累减少，包括water vs SPM中的原花青素B1、B2、B3、C1和C2，water vs IAA中的原花青素B1，water vs ETH中的原花青素B1、B3和C2。

图2 不同外源激素处理下代谢组分析。

3、ETH、IAA和SPM处理桑椹的RNA-seq分析

为深入了解花青素生物合成相关基因的表达模式，针对外源ETH、SPM、IAA和对照水处理的桑树果实样品进行了转录组分析（每组包含三个生物重复）。Clean reads与参考基因组的比对率为81.91%–94.44%。鉴定到了5514个新基因，其中2674个被注释，丰富了桑树的基因组信息。PCA分析中将ETH、SPM、IAA分为三组（图3C），与代谢组的分析相似，观察到了对照和激素处理之间的显著差异。

图3 不同外源激素处理下转录组分析结果。

4、外源激素处理桑果中差异表达基因分析

随后进行外源激素处理桑果中差异表达基因分析。韦恩图用于可视化不同比较组合中差异表达基因的重叠。water vs ETH比较组中包含5077个差异基因，water vs IAA比较组中包含3753个差异基因，water vs SPM比较组中包含4954个差异基因（图3A）。然而，在三种外源激素处理比较组中，仅观察到少数差异表达基因。ETH vs SPM比较组中鉴定了289个差异基因，在IAA vs ETH比较组中鉴定了646个差异基因，在IAA vs SPM比较组中鉴定了465个差异基因（图3B）。接下来，通过kmeans聚类分析，共鉴定出10个不同的基因表达簇。其中第6和第9簇显示出类似的表达模式（图3E）。

5、GO、KOG和KEGG的注释和鉴定

为进一步了解激素对类黄酮代谢途径的调控，作者进行了GO、KOG和KEGG富集分析。在GO分析中，观察到与对照相对，三种外源激素处理后主要在生物过程组分富集，然后是代谢过程和对刺激的反应。在ETH处理的果实中，基因大多聚集在生长素激活信号中。KOG数据库将基因注释到25个功能类别上，其中“通用功能预测”是基因数量最多，占18.6%，其他大类是翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣蛋白和信号转导机制。KEGG富集分析表明，与对照相比，IAA、SPM和ETH处理果实中的基因主要富集于次生代谢产物的合成和代谢途径。此外，ETH、SPM、IAA处理后基因主要富集于植物光合作用、光合作用天线蛋白、糖胺聚糖降解、糖酵解/糖异生和植物病原体相互作用途径，黄酮合成的结构基因如和富集到类黄酮生物合成途径。ETH、SPM和IAA处理后人类所需的9种必需氨基酸被上调，0.78%的差异表达基因（DEGs）也富集于植物激素信号转导和玉米素生物合成途径，且作者观察到ZR含量在ETH、IAA和SPM处理后的样本中显著增加。这些途径中基因表达的丰富性可以作为信号反馈给植物，促进黄酮类化合物的合成。

因此，作者重点关注三个处理组中参与植物激素信号传递的DEGs，几乎所有基因均上调，参与细胞增大植株生长、细胞分裂芽启动、茎生长诱导萌发、气孔关闭种子休眠、果实成熟衰老、细胞分裂和伸长、衰老胁迫响应和抗病能力。和在果实成熟衰老过程中表达上调。当结合代谢组和转录组数据分析时，观察到类黄酮途径的显著变化。

6、代谢和转录联合分析SPM、IAA和ETH对桑椹着色的影响

为了揭示激素处理对桑树代谢的影响，作者结合代谢组和转录组分析，发现虽然大多数显著改变的基因富集在次生代谢、代谢途径和类黄酮的生物合成中，但大多数显著改变的代谢物富集在花青素生物合成途径中。ETH处理主要影响337个代谢物合成，IAA处理影响294个代谢物合成，SPM处理影响335个代谢物合成。ETH、IAA和SPM处理均促进表没食子儿茶素、儿茶素、二氢槲皮素、二氢山奈酚、根皮苷、根皮素和圣草酚的合成。五羟黄酮特异性受到SPM处理影响，木犀草素仅在ETH处理中受到影响（图4A-C，4G-I）。作者使用一个网络图来表示每个途径中代谢物和基因表达相关性系数大于0.8的，图中代谢物用绿色标记，基因用红色标记，实线代表正相关，虚线表示负相关。类黄酮生物合成的网络图如图4 D-F所示，对羟基吡啶7-O-乙酰转移酶（）位于water vs ETH比较组的中心位置；UDP-糖基转移酶88A1-like（）位于water vs IAA比较组的中心位置；UDP-糖基转移酶88F5（）位于water vs SPM比较组的中心位置。

图4 不同外源激素处理下转录组和代谢组综合分析。

7、qRT-PCR验证

为了验证RNA测序数据的准确性，作者选择了糖酵解途径、磷酸戊糖途径、苯丙烷生物合成和类黄酮途径中的30个DEGs。通过RT-qPCR 分析了这些基因在不同外源处理29天样本中的表达水平。结果表明，这些基因的表达模式与RNA-seq结果一致验证了转录组数据的可信度和可靠性。除和外，糖酵解途径、磷酸戊糖途径、苯丙烷生物合成和类黄酮途径中几乎所有差异基因均在ETH、SPM和IAA处理后上调。而在ETH、SPM和IAA处理下，几乎不表达（图5）。

图5 不同外源激素处理后与色素沉着相关的类黄酮途径。

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