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猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法

来源：花匠小妙招时间：2025-04-20 10:20

技术特征：
1.猕猴桃aapg18基因，其特征在于，该基因序列长度为1191bp，序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述猕猴桃aapg18基因在猕猴桃新品种培育中应用，其特征在于，猕猴桃aapg18基因与猕猴桃果实软化成熟相关。3.针对权利要求1所述猕猴桃aapg18基因的转基因猕猴桃的单果验证方法，其特征在于，该方法以转基因瞬时表达系统为技术基础，针对猕猴桃单果进行转基因目的验证，具体包括如下步骤：（一）构建过表达重组载体以植物双元表达载体pbi121为载体，构建重组的pbi121-aapg18过表达载体，具体步骤包括：（1）获得目的基因首先，提取猕猴桃单果果实总rna，并反转录为cdna备用；随后，针对目的基因aapg18设计pcr扩增用引物，并以上述cdna为模板进行pcr扩增；pcr扩增过程中，pcr扩增用引物对设计如下：aapg18-f：5
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atgacaatggtgcaaccact-3’，aapg18-r：5
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ctacaagcaacttgagggctta-3’；最后，对pcr扩增产物电泳检测后提纯备用；（2）连接和转化利用t4连接酶，将步骤（1）中所制备目的基因aapg18与ped-t载体进行连接，随后，将连接产物转化，并进行筛选、验证，确保转化正确，并提取转化正确质粒备用；（3）同源重组利用步骤（2）中重组质粒，采用同源重组的方法，将aapg18连接到植物双元表达载体pbi121上，以构建获得重组质粒pbi121-aapg18；同源重组过程中，pcr引物对设计如下：pbi121-f：gagaacacgggggactctagaaagatgacaatggtgcaaccact，pbi121-r：gcccttgctcaccatggatcccaagcaacttgagggcttaactaa；（4）转化和筛选鉴定将步骤（3）中所构建的含有重组质粒pbi121-aapg18的重组体系进一步转化、筛选，并进行进一步测序验证，确保重组正确，并提取重组正确质粒备用；（二）制备转染液将步骤（一）中所构建重组质粒pbi121-aapg18转化gv3101农杆菌感受态细胞，筛选转化正确的菌株，并制备侵染液；（三）单果验证采集猕猴桃果实，利用带针头的注射器分别从果实左右两侧注射侵染液，确保侵染液在果实中得以渗透；注射后，室温18~25℃放置2-3天进行观察判断。4.如权利要求3所述针对猕猴桃aapg18基因的转基因猕猴桃的单果验证方法，其特征在于，步骤（三）中，所述猕猴桃果实，具体选择花后80天
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猕猴桃果实。

技术总结
本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一个猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法。猕猴桃AaPG18基因序序列如SEQ ID No.1所示。所述转基因猕猴桃的单果验证方法，以转基因瞬时表达系统为技术基础，首先构建重组的pBI121-AaPG18过表达载体，并制备侵染液，随后从猕猴桃果实左右两侧注射侵染液。总体上，本申请基于瞬时表达技术，结合猕猴桃果实特点，一方面对AaPG18基因功能进行了初步明确，另一方面设计提供了一种可对猕猴桃果实相关功能基因进行快速且严格的单果对照验证法，且其验证结果高效、直观、重复性强，且可较好克服果实异质性问题，从而减少相关功能基因验证的工作量和误差。的工作量和误差。

技术研发人员：齐秀娟李玉阔黄海雷顾红林苗苗孙雷明钟云鹏王然
受保护的技术使用者：中国农业科学院郑州果树研究所
技术研发日：2022.02.25
技术公布日：2022/5/6