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一种南瓜小孢子分化培养基的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-04-19 09:44

本发明涉及一种南瓜小孢子分化培养基，具体涉及一种大大提高了显著提高南瓜小孢子愈伤绿苗再生效率的南瓜小孢子分化培养基，属于蔬菜培育科学技术领域。

背景技术：

南瓜（cucurbitamoschata）属于葫芦科南瓜属的一年生蔓性草本植物，起源于美洲，在16世纪中叶明中期传入中国。南瓜全球目前栽培种主要有5个：中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜、灰籽南瓜和黒籽南瓜，在中国主要是栽培前3种。南瓜是人类最早栽培的古老作物之一，在公元前4050年就开始了美洲南瓜的栽培，公元前5000～3000年就有了中国南瓜和墨西哥南瓜的残片存在。

南瓜的营养、保健与药用价值较高，古代名医李时珍在《本草纲目》中对南瓜的作用有如下记载“补中，补肝气，益心气，益肺气，益精气”，凡久病气虚、脾胃虚弱、症见气短倦怠、食少腹胀、水肿尿少者宜用。近年来的研究结果亦表明，南瓜的营养成分丰富，其营养成分为水分90.24%、蛋白质0.65%、脂肪0.13%、碳水化合物6.08%、纤维2.15%、灰分0.73%，同时还含有丰富的胡萝卜素、维生素b、维生素c、维生素e、精氨酸、天门冬氨酸、腺嘌呤、果胶、甘露醇、叶红素、叶黄素及钙、钾、锌、铬等矿物质，特别是稀有氨基酸瓜氨酸含量达20.9mg/100g，果胶含量占南瓜干物质的7%-17%，脂肪含量却非常低。南瓜具有多种食疗保健作用和药用价值，近年来，国内外研究表明，南瓜具有降血糖、降血脂、解毒、保肝肾、防治癌症及肥胖症等保健与药用功效。随着人们对南瓜认识的不断加深，国内外逐渐开始对南瓜进行综合开发利用，目前市场上出现的系列南瓜产品有南瓜粉、南瓜酱、南瓜罐头、南瓜果脯、三合味南瓜片、南瓜蜜钱瓜干、南瓜晶、南瓜糊、南瓜糕点、南瓜饮料、南瓜冰淇淋、什锦瓜果、南瓜果冻、南瓜酱油、南瓜火腿、南瓜营养汁等多种品种。

在我国，南瓜的保健作用正渐渐被人们认识了解，南瓜食品越来越受到人们的喜爱。南瓜对环境适应力极强，极易生长，在我国各地普遍栽培，而且运输和保存比较方便。南瓜在中国的种植面积为76万hm2，总产量为1616万吨，面积和总产量分别占全世界的10.3%和20%，我国是南瓜生产世界第一大国。开发南瓜产品，开展南瓜深加工的研究，对发展南瓜的种植及丰富保健食品市场都有较大的意义。

随着南瓜国际国内市场需求的紧俏，优质、抗病、丰产的南瓜良种培育成为蔬菜培育科研人员的研究主题之一。南瓜是异花授粉植物，杂交优势非常明显，目前主要采用杂交育种方法进行南瓜新品种培育。传统杂交育种方法存在周期长、效率低等突出问题，育成一个稳定优良自交系一般需要6-8年，甚至更长时间，选育自交系非常费事、费工。近年来随着人工成本的增加，常规育种的不足在实际工作中日渐明显。因此，迫切需求南瓜育种的新途径和新方法。

单倍体育种与常规多代自交获得纯系相比，具有周期短、效率高、纯系稳定等特点。游离小孢子培养是单倍体育种技术中快速获得纯系的一种有效方法，同单倍体育种技术中的花药培养相比，游离小孢子培养消除了小孢子和花药壁、级链层细胞之间可能存在的营养竞争，往往培养成功的基因型多，胚状体诱导频率也高，同时去除了花药壁、级链层细胞等体细胞再生植株的干扰，从而可以提高选择的准确性，提高育种效率和品种质量。

游离小孢子分化培养是继诱导培养之后的单倍体培养的又一重要程序，是将游离小孢子诱导出愈伤组织后进而将愈伤组织分化出绿苗的过程，目前，国内外学者通过优化培养基和改进培养方法，使部分蔬菜小孢子愈伤组织的分化效率作出了提升，但是南瓜游离小孢子分化培养的研究还比较少，因此南瓜花培育种体系的建立还必需高效可用的南瓜小孢子分化培养基的研发。通过多年摸索和实践，我们参照其它蔬菜种的基本培养基配方并进一步优化，并且不断尝试加入一些提高南瓜小孢子愈伤分化效率的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种南瓜小孢子分化培养基，使得南瓜花培育种体系得以建立和完善。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种大大提高了显著提高南瓜小孢子愈伤绿苗再生效率的南瓜小孢子分化培养基。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种南瓜小孢子分化培养基，其特征在于：该培养基的配方如下：

kno31800-2200mg/l，苯乙酸钾340-380mg/l，氯化2-羟乙基三甲铵75-85mg/l，mgso4∙7h2o320-360mg/l，cacl2∙2h2o270-330mg/l，(nh4)2so490-110mg/l，nah2po4∙h2o120-140mg/l，na2-edta35.6-39mg/l，feso4∙7h2o26-29.6mg/l，mnso4∙4h2o15-17mg/l，h3bo33.2-3.8mg/l，znso4∙7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.7-0.8mg/l，na2moo4∙2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4∙5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2∙6h2o0.02-0.03mg/l，谷氨酰胺450-550mg/l，维生素b10.5-0.6mg/l，维生素b60.7-0.8mg/l，2-吗啉乙磺酸75-85mg/l，3-吡啶甲酸0.7-0.8mg/l，肌醇90-110mg/l，山梨醇27-33g/l，三十烷醇1.3-1.7mg/l，甘氨酸1.8-2.2mg/l，赖氨酸1.1-1.3mg/l，胰岛素0.5-0.7mg/l，蔗糖17-23g/l，麦芽糖9-11g/l，植物凝胶5.3-5.7g/l，kt1.3-1.7mg/l，6-ba1.8-2.2mg/l，naa0.4-0.6mg/l，调钙酸钙0.35-0.45mg/l，秋水仙素0.4-0.6mg/l，水解蛋白0.9-1.1g/l，活性炭25-35mg/l，ph5.4-5.8。

本发明所提供的南瓜小孢子分化培养基，是在现有其它蔬菜种的研究基础之上进一步创造性改良的成果，是经过大量试验所筛选的最优组合，我们进行了大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。通过本发明和其它蔬菜种小孢子分化培养基对南瓜小孢子愈伤组织分化效果的比较发现，本发明对南瓜愈伤组织的分化效果是最优的，充分说明了本发明可以显著提高南瓜小孢子愈伤的绿苗再生效率、对南瓜的种属适应性最佳。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种南瓜小孢子分化培养基，其特征在于：该培养基的配方如下：

将南瓜种子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧长至3-4米后进入初花期，选择单核晚期南瓜花蕾进行取材，然后将选材的南瓜花蕾置于4℃冰箱内低温预处理1-2d，预处理后将花蕾转移入超净工作台进行游离小孢子的分离并接种，将南瓜游离小孢子转移入南瓜游离小孢子诱导培养基中，33℃热激处理48h后转入25℃暗培养直至胚性愈伤组织形成。当诱导培养的南瓜小孢子愈伤组织长到0.3-0.5cm大小时，转到本发明所提供的南瓜小孢子分化培养基中诱导绿苗，培养条件控制为：温度25-27℃、湿度75%-85%、光照2000-2500lx、光周期光l2h/暗12h。再生绿苗产生后，计算绿苗再生率。

绿苗再生率（%）=绿苗数/转移的愈伤块数×100%。

实施例

配制本发明所述的一种南瓜小孢子分化培养基，培养基配方具体如下：

kno32000mg/l，苯乙酸钾360mg/l，氯化2-羟乙基三甲铵80mg/l，mgso4∙7h2o340mg/l，cacl2∙2h2o300mg/l，(nh4)2so4100mg/l，nah2po4∙h2o130mg/l，na2-edta37.3mg/l，feso4∙7h2o27.8mg/l，mnso4∙4h2o16mg/l，h3bo33.5mg/l，znso4∙7h2o9mg/l，ki0.75mg/l，na2moo4∙2h2o0.25mg/l，cuso4∙5h2o0.025mg/l，cocl2∙6h2o0.025mg/l，谷氨酰胺500mg/l，维生素b10.55mg/l，维生素b60.75mg/l，2-吗啉乙磺酸80mg/l，3-吡啶甲酸0.75mg/l，肌醇100mg/l，山梨醇30g/l，三十烷醇1.5mg/l，甘氨酸2mg/l，赖氨酸1.2mg/l，胰岛素0.6mg/l，蔗糖20g/l，麦芽糖10g/l，植物凝胶5.5g/l，kt1.5mg/l，6-ba2mg/l，naa0.5mg/l，调钙酸钙0.4mg/l，秋水仙素0.5g/l，水解蛋白1g/l，活性炭30mg/l，ph5.6。

将锦红一号和黄金二号的南瓜种子在春季3月份中旬播于大田，待南瓜秧长至3-4米后进入初花期，选择单核晚期南瓜花蕾进行取材，然后将选材的南瓜花蕾置于4℃冰箱内低温预处理40h，预处理后将花蕾转移入超净工作台进行游离小孢子的分离并接种，将南瓜游离小孢子转移入南瓜游离小孢子诱导培养基中，33℃热激处理48h后转入25℃暗培养直至胚性愈伤组织形成。当诱导培养的南瓜小孢子愈伤组织长到0.3-0.5cm大小时，转到本发明所提供的南瓜小孢子分化培养基中诱导绿苗，培养条件控制为：温度25-27℃、湿度75%-85%、光照2000-2500lx、光周期光l2h/暗12h。再生绿苗产生后，计算绿苗再生率。

为了比较本发明所提供的南瓜游离小孢子分化培养基各组分的配比效果，我们对本发明提供的南瓜游离小孢子分化培养基进行了组分改变的单因子试验，试验品种亦采用锦红一号和黄金二号，小孢子愈伤组培操作方法、培养方法均相同，绿苗分化形成后分别统计锦红一号和黄金二号的胚性愈伤组织在各培养基内的小孢子愈伤组织绿苗分化率。

单因子试验的试验组分分别为：苯乙酸钾、氯化2-羟乙基三甲铵、谷氨酰胺、2-吗啉乙磺酸、山梨醇、三十烷醇、胰岛素、调钙酸钙，各组分因子梯度浓度设置和试验结果如下表1-8。

由表1到表8的南瓜小孢子分化培养基组分改变的单因子试验可以发现，三十烷醇、胰岛素、调钙酸钙配比的增加产生了不利效应；而苯乙酸钾、氯化2-羟乙基三甲铵、谷氨酰胺、2-吗啉乙磺酸、山梨醇的增加不能显著增加培养基的分化效果，由于这些添加物的增加会提高培养基的配制成本，在培养基诱导效果达最优值的最小配比量是综合生产成本后的最佳配比。由此可见，进行任何培养基组分的增加或减少均是不利的，同时说明本发明的组分配比是最优的。

实施例2

为了比较本发明所提供的南瓜小孢子分化培养基与其它培养基对南瓜小孢子胚性愈伤组织绿苗分化效率的差异，我们另外选择了2种小孢子分化培养基，试验材料亦采用锦红一号和黄金二号的胚性愈伤组织，小孢子愈伤组织的获取方法、组培操作方法、培养方法均与实施例1相同，绿苗分化后分别统计锦红一号和黄金二号的小孢子胚性愈伤组织在该2种培养基内的小孢子愈伤组织绿苗分化率。

其它2种小孢子分化培养基配方为：

ms基本培养基+1mg/l2，4-d+1mg/lkt+1mg/lba+1mg/l三十烷醇，ph为5.8（对比文件来自于袁万良等《西瓜花培试验初报》）；

ms基本培养基+0.2mg/l6-ba+3%蔗糖+0.8%琼脂，ph为5.8（对比文件来自于詹燕等《黄瓜游离小孢子培养诱导成胚和植株再生》）。

培养基对比实验

将采用本发明所提供的培养基对锦红一号和黄金二号的小孢子胚性愈伤统计所得的小孢子愈伤绿苗分化率与对比实施例的锦红一号和黄金二号小孢子愈伤组织绿苗分化率进行比较，比较结果如下表9所示。

由表9可以发现，本发明所提供的南瓜小孢子分化培养基对南瓜品种锦红一号和黄金二号小孢子愈伤绿苗分化率平均值达到了29.1%，而前人所采用的两种培养基对南瓜品种锦红一号和黄金二号的小孢子愈伤绿苗分化率平均值分别仅为13.2%和6.7%，可以发现本发明所提供的南瓜小孢子分化培养基对南瓜小孢子胚性愈伤的绿苗分化率做出了显著的提升。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。