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一种金丝桃属植物活性挥发油的制备方法

来源：花匠小妙招时间：2025-04-17 18:05

一种金丝桃属植物活性挥发油的制备方法

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种金丝桃属植物挥发油的制备方法。

背景技术：

2.金丝桃属（hypericum）植物系金丝桃科的灌木或多年生至一年生草本，在全世界范围内广泛分布，我国约有64种，主要分布在西南地区。民族植物学调查显示，白族、傣族、独龙族、羌族、佤族、彝族、藏族等多个少数民族对该属植物有丰富的使用经验和文化；国外也有利用金丝桃属植物作为药用的传统。除了显著的抗抑郁作用，用传统方法提取的贯叶连翘橄榄油浸渍提取物在欧美地区普遍用于皮肤护理，其功效包括促进伤口愈合、烧伤烫伤、痔疮等。此外，亚洲特有种短柱金丝桃h. hookerianum、美丽金丝桃h. bellum和北栽秧花h. pseudohenryi这三种民间药用植物多用于治疗烧伤、烫伤、蛇咬伤、肝炎及感冒等疾病。药物化学研究显示，金丝桃属植物不同部位提取的挥发油中富含金丝桃素、金丝桃苷、绿原酸、咖啡酸、以及槲皮素等活性成分。药理学研究显示该属植物除了显著的抗抑郁，抗病毒，抑制肿瘤细胞生长等活性外，金丝桃属植物的提取物还具有多种皮肤保护活性，如抗菌消炎、消肿止痛、美白养肤等功效。因此，该植物在医药、食品和美容化妆品等领域具有较大的开发潜力。
3.虽然金丝桃属植物资源种类较多、分布较广，传统医药用途广泛，其挥发油具有多种利用价值和较好的生物活性，但是我国对该属植物资源的保护、开发和利用仍处于初级阶段。目前，金丝桃属植物的人工培育规模十分有限，随着市场对金丝桃属植物延伸产品需求的不断增加，已难以保证植物原料的保障供给。其次，目前科学研究及产品研发使用的多为野生资源，且提取方法简单、提取率较低。第三，在经济快速发展的情况下，该属植物原生境受到很大干扰，其生存环境受到多种威胁。为了进一步改善金丝桃属植物资源保护现状，亟需开展该属植物资源利用的相关工作。提升植物资源的利用效率，是促进该类植物资源与生物多样性保护的重要措施之一。
4.与传统水蒸馏法提取挥发油相比，超临界co2萃取法使用溶剂无害无毒，在提取过程中不会残留溶剂，不会因高温破坏天然产物结构，且生产工序简化。但该工艺在金丝桃属植物中应用较少，因此将超临界co2萃取方法应用于该属植物挥发油的萃取，可同时满足保证提取成分的多样性及不破坏活性的需求。基于此，本发明改进了过往专利的提取条件，提升了金丝桃属植物挥发油的提取率。

技术实现要素：

5.本发明立足于植物资源利用的高效性和科学性，为充分发挥金丝桃属植物的价值，提供了一种活性良好且效率更高的挥发油提取方式。第一，该提取方式收获的挥发油具有较好的抗炎、抗菌和抗氧化活性，可以为各种实验节省成本、提供良好样本。其次，本发明提出的挥发油提取方式操作简便，容错率高，重复性强，有利于进一步推广和规模化生产。
6.本发明因此提供一种具有多种良好活性的金丝桃属植物挥发油的制备方法，具体
自由基清除。
19.图4a 贯叶连翘不同部位的挥发性成分比较分析。
20.图4b 短柱金丝桃不同部位的挥发性成分比较分析。
21.图4c 美丽金丝桃不同部位的挥发性成分比较分析。
22.图4d 北栽秧花不同部位的挥发性成分比较分析。
具体实施方式
23.为了使得本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效更便于理解，下面通过具体实施例对本发明进行阐述，但并不对本发明构成限制。
24.实施例一：提取物制备实施例一种具有抗炎活性、抗菌活性、抗氧化活性与络氨酸酶抑制活性的的金丝桃挥发油的提取制备方法，包括以下详细步骤：（1）植物干燥：取贯叶连翘（巫溪种群）、贯叶连翘（巫山种群）、北栽秧花、短柱金丝桃和美丽金丝桃新鲜成熟植株的花期地上部分，将植株分离成枝和叶两部分，编号、分置，而后在通风处进行干燥处理；（2）植物粉碎：将干燥后的植物样品进行粉碎，得到的样品粉末过40目筛，过筛后得到的样品粉末依旧分置并备用；（3）超临界co2萃取：称取粉碎样品15g，填充于50 ml萃取釜中，萃取条件为：温度40 ℃，萃取压力350 bar，动态萃取1小时，二氧化碳流速为3 ml/min。
25.（4）减压分离：含有萃取物的co2从萃取釜中流入分离釜，此时分离釜的温度控制在80℃，减压分离后得到4种金丝桃属植物不同部位的co2提取物，即为本发明的金丝桃属植物活性挥发油，编号、分置，并于4℃下保存。结果如表1所示。
26.表1、4种金丝桃属植物采集地点及挥发油提取率a含油量=提取油重量/样品重量(15g) 表1中结果表明，4种金丝桃属植物挥发油提取率叶》枝，同种不同种群的贯叶连翘提取率相近，短柱金丝桃提取结果最好。其中，该研究应用超临界co2萃取技术提取有效提高了挥发油提取率。种间及同种不同部位挥发油提取率变化很大，变化范围0.4%-5.4%。
27.实施例二：提取物的活性验证实施例以下是根据本发明获得的金丝桃属植物活性挥发油的神经保护活性、抗菌活性、体外抗氧化活性以及络氨酸酶抑制活性实验，挥发油提取样品溶解于dmso，最终加样浓度
cfu/ml；37
ꢀ°
c培养24 h，酶标仪测定625 nm下的od 值。实验同时设置培养基空白对照、细菌对照以及头孢他啶、青霉素g钠阳性药对照。
34.（2）抗真菌实验取96孔培养板，将待测样品进行稀释，各孔加入白色念珠菌箘液，终浓度为1
ꢀ×ꢀ
105 cfu/ml，37
ꢀ°
c培养24 h，酶标仪测定625 nm 下的od值。实验同时设置培养基空白对照、白色念珠菌对照以及两性霉素b阳性药对照。
35.实验结果如表2、表3所示。
36.表2金丝桃属植物挥发油抗细菌及真菌活性（500 μg/ml）注：nd表示未检测到；青霉素g采用5μg/ml），头孢他啶采用5μg/ml），而两性霉素b采用0.5 μg/ml。
37.表3金丝桃属植物挥发油对金黄色葡萄球菌亚种的mic
50
值表2中的结果表明，按照实施例一得到的6种提取物对真菌和细菌的生长具有程度
溶液；室温避光保存12-16小时，使用前，用纯乙醇稀释abts+试剂，至734nm波长下，吸光度在0.700
±
0.02 au。
44.d. 5mm trolox:向25ml的容量瓶中加入0.0313g trolox，用乙醇定容，最后稀释母液到0-2mm。向96孔板中加入样品/标准品2ul，在分别加入198 ul的abts+试剂，测量波长为734nm，时间为40min，间隔5min记录一次吸光值。
45.（2）dpph自由基清除实验用乙醇溶解配制成400 μm的dpph溶液。dmso溶解样品溶解样品，配制成不同浓度梯度的待测样品。96孔板上，每孔分别加入50 μl待测样和150 μl的dpph溶液，避光放置在避光放置在37℃恒温箱反应30min，酶标仪测定515 nm的吸光度值。
46.自由基抑制率（%） =（吸收值对照组
ꢀ‑
吸收值样品组）/(吸收值对照组 )
ꢀ×ꢀ
100%。
47.dpph抗氧化结果显示（图3）短柱金丝桃》北栽秧花和美丽金丝桃（无显著性差异，p 》 0.05）》贯叶连翘（巫山）》贯叶连翘（巫溪）。abts抗氧化结果显示（图3），北栽秧花》短柱金丝桃》美丽金丝桃》贯叶连翘（巫溪）》贯叶连翘（巫山）。3个亚洲特有种的自由基清除能力均大于目前该属广泛使用的贯叶连翘。
48.综上所述，由实施例一得到的金丝桃属植物提取物具有多种活性，足以满足神经保护活性、抗菌活性、体外抗氧化活性以及络氨酸酶抑制活性等多种目的的研究需求，具有广泛的使用前景和适用场景。
49.实施例三：提取物挥发性化学成分分析将实施例一制备得到的待分析提取物各取500 μl，挥发油由正己烷溶解并把浓度保持在1 mg/ml，混合成质控样品（qc）。每个样品进样3次，在进样列表的开始设置3针空白及qc质控样品来平衡柱子。而后采用gcms-qp2010仪器系统进行检测，该系统配备有四级杆质量检测器，aoc20i自动进样器（分流/不分流split/splitless），slb-5 ms气相色谱柱（10 m
ꢀ×ꢀ
0.1mm，i.d. 0.1 μm）。设置以下升温程序进行样品分析：起始温度60 ℃，保持0.5 min，随后 10 ℃/min升温到220 ℃，再以3 ℃/min升温到280 ℃，保持10 min。氦气（纯度99.99%）作为载气，并维持恒定流速0.56 ml/min；载气线速度设定为46.8 cm/sec。进样口温度280℃，进样量1 ul，分流比30：1。电子轰击离子化（electron-impact ionization，ei）能量设定70 ev，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，质量扫描范围30-500 amu，扫描速率0.1 s/scan。相对含量由峰面积计算：相对含量（%）=单个化合物峰面积/所有化合物的总峰面积
×
100%。四种金丝桃属植物中，共鉴定145个挥发性成分，种内种间表现出差异性，具体如表5所示。
50.在贯叶连翘中，共鉴定出56个挥发性成分，在pca图（图4a）中，可以看出两个种群不同部位化学成分差异很大，聚集成4簇，但是2个种群植物全株聚集成1簇，说明巫山及巫溪采集的贯叶连翘挥发性成分相近，不同部位化学成分差异大。巫溪采集的贯叶连翘烯醇类主要有十二烷基庚基醚（docosylheptyl ether）（31.32%），戊基四丁基醚（pentyltetracosyl ether）（5.37%）， 2-甲基-2-癸醇（2-methyl-2-decanol）（3.43%）；烷烃类主要有庚烷（heptacosane）（1.29%）；脂肪酸类主要有亚油酸戊酯（pentyl linoleate）（1.02%）。巫山采集的贯叶连翘酮类化合物主要有十二烷基庚基醚（docosylheptyl ether）（28.05%），2-壬酮（2-nonanone）（6.84%），烯醇类主要化合物2-甲
基-2-癸醇（2-methyl-2-decanol ）（5.01%），烷类化合物主要有十一烷（undecane）（2.86%），氧化的单萜类化合物主要有芳樟基氧化物（linalyl oxide）（2.29%），脂肪酸类化合物主要有亚油酸戊酯（pentyl linoleate）（2.19%）。
51.在短柱金丝桃中（如图4b展示的pca图），共鉴定出71个挥发性成分，主要成分为烷烃（56.01%），烯醇类（15.66%），氧化的单萜（4.85%）和倍半萜（4.69%）。烷烃类主要有三金刚烷（triacontane）（26.39%），1-碘四烷（1-iodotetracosane）（20.63%），链烯醇类主要有2-甲基-2-癸醇（2-methyl-2-decanol ）（14.83%），氧化的单萜主要有碳酸2-（5-乙烯基-5-甲基氧戊环-2-基）丙-2-基乙酯（2-（5-ethenyl-5-methyloxolan-2-yl） propan-2-yl ethyl carbonate ）（3.85%），倍半萜主要有芳萜烷（aromadendrane）（1.28%）。
52.在美丽金丝桃中（如图4c展示的pca图），共鉴定出43个挥发性成分，主要成分有氧化的倍半萜（31.32%），醚类（24.89%）和脂肪酸（1.59 %），包括姜黄酮（curdione）（30.91%），二十烷基壬基醚（eicosylnonyl ether）（15.5%），十一碳烯酸10-丁酸酯（undec-10-ynoic acid, but-3-yn-2-yl ester）（9.39%），棕榈醇棕榈酸酯（palmitylpalmitoleate）（9.33%）。
53.在北栽秧花中（如图4d展示的pca图），共鉴定出57个挥发性成分，主要成分为烷类（5.27%）和脂肪酸（1.94%），烷类主要成分有庚烷（heptacosane）（2.71%），氧化的二萜主要成分有香叶基香叶醇（geranylgeraniol）（1.93%），脂肪酸主要成分有棕榈酸（palmitic acid ）（1.82%）。
54.表5 四种金丝桃属植物挥发油的成分a化合物按照洗脱顺序列出，通过与wiley275和nist2017数据库的ri和ms比较进行鉴定。
55.b
线性保留指数，用c12-c30烷烃进行实验测定。