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利用活体玉米植株人工饲养繁殖玉米蚜的方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-04-05 16:37

本发明涉及玉米蚜虫的人工培养技术领域，尤其涉及一种利用活体玉米植株人工饲养繁殖玉米蚜的方法。

背景技术：

蚜虫是一种极为常见的农作物害虫，其宿主范围广泛，可对几乎所有的主要栽培作物造成危害。蚜虫属于同翅目(homoptera)蚜科(aphididae)，俗称腻虫或密虫。世界上约有近5000多种蚜虫，其中对玉米造成主要危害的是玉米蚜(rhopalosiphummaidis)，其次是高粱蚜(melanaphissacchari)。玉米蚜广泛分布于我国东北、西北、华北及华中地区，其寄主植物种类繁多，不仅包括玉米、高粱、水稻、小麦等禾本科作物，还包括稗草、马唐、马尾草等杂草。玉米蚜的成虫及若虫通过刺吸植物韧皮部汁液直接为害农作物，还可传播大麦黄矮病毒、玉米矮花叶病等植物病毒，引起作物病毒病的流行，造成病害。玉米蚜取食时分泌的蜜露分布于植物叶片表面，不仅影响植物的光合作用，还能引起煤污病，影响植株生长发育，严重时造成植株枯死。蚜虫若在玉米抽穗期为害雄花和雌穗，会造成开花期推迟，籽粒不饱满，品质和产量下降等直接危害。近年来，随着农业生产向规模化、集约化转变，及玉米种植制度的改变和种植密度的加大，以及夏季天气高温、干旱、少雨等环境因素的影响，蚜虫的危害越来越突出，可造成玉米减产10-20％，严重年份减产超过30％。而蚜虫的防治却一直是农业生产中的难题，因蚜虫有着极高的繁殖率，单头蚜虫可在6星期内生产5.9万个后代，而且玉米蚜分为无翅蚜和有翅蚜两种生态型，具有迁移性，严重影响农药防治的效果，并且使用农药防治除了成本高外，还会破坏生态系统并造成环境的污染。此外，研究表明玉米蚜的发生程度、危害时期不仅与温度、湿度、降雨和天敌数量有直接关系，还与作物布局和玉米种植面积有着密切的关系。因此培育高抗玉米蚜的抗性品种是最经济有效的防治玉米蚜的途径，而抗蚜虫基因的挖掘是抗性育种的前提。为了玉米蚜抗性鉴定的准确性、抗性种质的筛选、抗性基因的精细定位及进一步抗性品种的选育，对蚜虫进行精准的生物型繁殖，才能为抗蚜基因的精确定位克隆研究、分子标记辅助育种及抗蚜性玉米品种选育创造条件，从根本上达到防治效果。

在对蚜虫的研究中，获取蚜虫样本可通过田间收集或人工饲养的方式。玉米蚜在我国北方每年可发生10余代，以无翅胎生雌蚜在小麦苗及禾本科杂草上越冬；在4月底5月初有翅蚜向春玉米、高粱地迁飞进行危害；在夏播玉米生殖生长期，向夏播玉米田扩散，这时虫量成倍增长，进入严重危害阶段；10月上、中旬，玉米逐渐衰老，玉米蚜最后产生一次有翅蚜，迁入麦田进行危害和越冬；因此田间收集玉米蚜受到蚜虫迁飞、季节、天气等多种因素的影响，使抗蚜鉴定效率低且结果不可靠。而蚜虫的人工饲养，目前常采用固体培养基在固定容器中饲养，如中国专利申请cn201710099350.1，该饲养方法虽然能成功获得蚜虫的繁殖，但得到的蚜虫样本因人工饲养方式的定向诱导，与自然环境捕集的蚜虫样本在生物、遗传、基因特性方面存在差异，造成研究结果与自然防治效果产生较大差异，不利于实际应用。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种利用活体玉米植株人工饲养繁殖玉米蚜的方法，由该方法繁殖得到的玉米蚜具有与自然捕获的玉米蚜相同的生物特性和遗传特性，对研究玉米蚜的生物型差异、蚜虫的防治、研究玉米抗蚜机理、遗传、鉴定方法具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供的利用活体玉米植株人工饲养繁殖玉米蚜的方法，选择由壤土与营养土混合得到的配方土作为活体玉米植株的培养基质，先在培养基质里播种易感蚜玉米品种种子，然后在人工气候箱内培养玉米植株，待玉米植株长至两叶一心期接种玉米蚜虫源，之后在人工气候箱内继续培养玉米植株生长的前提下，进行玉米蚜的饲养繁殖。

本发明的玉米蚜饲养繁殖方法，是通过在易感蚜玉米植株的人工培养、生长进程中进行人为接虫、饲养、和繁殖玉米蚜这种生物型蚜虫的方式，获得更接近自然状态下玉米蚜的繁殖过程，从而得到与自然捕获的玉米蚜具有相同生物特性和遗传特性的大量玉米蚜样本，为玉米蚜的研究提供有效样本，有利于蚜虫精准的生物型研究，及准确的玉米抗蚜性鉴定、抗性种质的筛选、抗性基因的精细定位及进一步抗性品种的选育；而且此方法相较于自然捕集方式，对蚜虫样本的提供更稳定、更具普遍意义；相较于其他人工饲养方式，能够减少因人为干预因素造成对蚜虫样本生态型的影响，从而获得更准确的研究结果和更有效的防治手段。在本发明的饲养繁殖方法中，玉米植株的培养与玉米蚜的饲养繁殖是密切关联且相互影响的，既要使玉米植株能够尽早进入生殖生长期，为玉米蚜提供优异的宿主环境，又不能因促进玉米植株的生长而使玉米蚜的繁殖受到限制，因此培养基质的选择、玉米植株的培养、以及玉米蚜接种时期的确定、玉米蚜的饲养繁殖条件等因素相互关联、相互协调，以获得大量有效的玉米蚜样本。

作为对上述技术方案的限定，所述利用活体玉米植株人工饲养繁殖玉米蚜的方法包括以下步骤：

a、活体玉米植株的培养基质配制：将壤土与营养土按体积比(1～3):1混合均匀，得到的配方土即为培养基质；

b、培养玉米植株：在培养基质里播种易感蚜玉米品种种子，然后在人工气候箱内于昼温25～31℃、夜温18～20℃、湿度55～70％、光照强度9600lx、光照时间7～12小时条件下培养玉米植株的生长；

c、饲养繁殖蚜虫：待玉米植株长至两叶一心期接种玉米蚜虫源，之后在人工气候箱内于昼温25～31℃、夜温18～20℃、湿度55～70％、光照强度9600lx、光照7～12小时条件，在继续培养玉米植株生长的前提下，进行玉米蚜的饲养繁殖。

进一步限定饲养繁殖方法中活体玉米植株的培养基质，以及适宜玉米植株和蚜虫共同生长的温度、湿度、光照条件下，其中控制玉米培养和蚜虫饲养繁殖的条件保持一致，使玉米和蚜虫都能够得到良好生长，以达到对玉米蚜的人工饲养繁殖更接近自然环境下蚜虫的繁殖，得到大量、可靠的玉米蚜样本。

作为对上述技术方案的限定，所述配方土中壤土与营养土的体积比为3:1。

作为对上述技术方案的限定，所述易感蚜玉米品种包括品种名为s221、ph6wc、js06330的玉米材料。

作为对上述技术方案的限定，步骤b、c所述人工气候箱内的培养条件为昼温28℃、夜温20℃、湿度70％、光照10小时。

作为对上述技术方案的限定，所述玉米蚜虫源的接种量为每株玉米植株接种至少3头玉米蚜。

进一步细化饲养繁殖方法中配方土优化配比、易感蚜玉米品种、最优的玉米植株培养条件和玉米蚜饲养繁殖条件、接虫量等条件因素，使该方法能够顺利且优化的实施。

综上所述，采用本发明的技术方案，获得的玉米蚜饲养繁殖方法，是通过在易感蚜玉米植株的人工培养、生长进程中进行人为接虫、饲养、和繁殖玉米蚜的方式，获得更接近自然状态下玉米蚜的生长繁殖过程，从而得到与自然捕获的玉米蚜具有相同生物特性、遗传特性的大量玉米蚜样本，为玉米蚜精准的生物型研究，及准确的玉米抗蚜性鉴定、抗性种质的筛选、抗性基因的精细定位及进一步抗性品种的选育提供有效样本，且提供的蚜虫样本更稳定、更具普遍意义，不受季节变化和其它自然环境的限制，并极大减少因人为干预因素造成对样本性能的影响，从而获得更准确的研究结果和更有效的防治手段。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例的不同培养基质种植模式比较照片；

图2是本发明实施例中玉米不同时期蚜虫繁殖照片；

图3是本发明实施例的不同光周期下玉米植株高度比较照片；

图4是本发明实施例中玉米生长天数与蚜虫数量变化趋势图；

图5是利用人工气候箱培育活体玉米植株饲养繁殖玉米蚜照片；

图6是本发明实施例饲养繁殖的玉米蚜不同发育时期显微镜观测照片；

图7是本发明实施例饲养繁殖的玉米蚜线粒体上coi基因测序的dna序列结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本实施例涉及利用活体玉米植株人工饲养繁殖玉米蚜的方法，按如下步骤进行：

a、培养基质的配制：将壤土与营养土按体积比(1～3):1混合均匀，得到的配方土即为培养基质；

壤土，取自河北省农林科学院粮油作物研究所堤上试验站，用于种植玉米的农田轻壤土，有机质含量13.0～14.6g/kg，全氮1.14～1.20g/kg，全磷1.5～1.6g/kg，碱解氮76.5～81.4mg/kg，有效磷23.12～26.22mg/kg，有效钾103.5～106.0mg/kg。土样经筛去石块等较大颗粒物后备用；

营养土，为从市场购买的植物通用营养土(长白山牌)，是按科学的方法配制而成的，含有丰富的有机肥、长效缓释肥和多种有益微生物，ph值为5.5～6.5，主要成分：泥炭、蛭石、珍珠岩、湿润剂、腐殖酸、长效缓释肥及多种有益微生物；

b、培养玉米植株：将培养基质装入培养钵或花盆内至离口1～2cm处，然后放入易感蚜玉米品种(如玉米材料s221、ph6wc、js06330等)种子，再加培养基质至满，浇水后在人工气候箱内于昼温25～31℃、光照强度9600lx、光照时间7～12小时，夜温18～20℃、光照强度0lx，湿度55～70％条件下培养玉米植株的生长；

c、饲养繁殖蚜虫：待玉米植株长至两叶一心期接种玉米蚜虫源，每株接种至少3头，之后在人工气候箱内于昼温25～31℃、光照强度9600lx、光照时间7～12小时，夜温18～20℃、光照强度0lx，湿度55～70％的条件，在继续培养玉米植株生长的前提下，进行玉米蚜的饲养繁殖，得到人工饲养繁殖的玉米蚜，可作为各类研究样本使用。

实施例二

本实施例涉及饲养繁殖玉米蚜方法中各条件因素的选择及其影响。

实施例2.1

培养基质的选择。

试验方法：将s221、ph6wc、js06330三份玉米材料，分别种植在营养液、营养土、壤土三种基质中，每份玉米材料均种3盆，共计9个试验样品，每个样品种植两株玉米植株，在人工气候箱中培养，培养条件为湿度70％，白天温度25℃、光照强度9600lx，夜间温度18℃、光照强度0lx，光照周期昼/夜为14小时/10小时。

其中，营养液培养方式是将玉米种子放在蒸馏水中浸泡24h，膨胀吸水后转移到铺有水分饱和的滤纸培养皿中培养，直至种子发芽(24-48h，中间补充水分)，再将发芽的种子用泡沫固定，放在小花盆内，倒入适当的营养液进行培养。营养液的配制：采用用于植物组织培养的不含琼脂和蔗糖的ms培养基(产品编号：hb8469-5)，称取4.74克ms培养基加热溶解于1000毫升蒸馏水中，115℃高压灭菌30分钟备用，使用时用3m的盐酸调到ph值为7.0。

试验结果：如图1所示，三份玉米材料在壤土和营养土生长发育较好，而生长在营养液中的玉米幼苗，因营养液不能满足玉米幼苗生长发育所需营养，下部根系生长良好，上部叶片发黄萎蔫。将玉米幼苗根据叶片的长势进行调查汇总，见表1。

表1玉米植株苗期生长情况

本试验结果表明：(1)营养液易生菌，并不能满足植株正常生长发育各个时期所需营养，且经济成本较高；(2)壤土的经济成本低，取材方便，植株生长正常，但透气性差；(3)营养土经济成本适中，透气性好，植株能正常生长，但保水性差。因此通过进一步采用壤土与营养土的体积比分别为1:1、2:1、3:1的配方土作为玉米生长基质，根据玉米幼苗的长势发现3:1的配方土最适宜玉米生长，确定壤土与营养土的体积比为3:1的配方土作为玉米生长基质，用于饲养蚜虫的玉米植株的培养。

实施例2.2

玉米植株培养条件和适于玉米蚜繁殖的玉米生长时期的确定。

试验方法：9盆播种易感蚜玉米品种ph6wc的试验样品，分成3组，每组3盆，每盆2株玉米。在人工气候箱内，湿度为70％，夜间温度为18℃，白天温度分别为25℃、28℃和31℃，光照周期对应分别是昼/夜为8小时/16小时、昼/夜为10小时/14小时和昼/夜为14小时/10小时的3个环境下，先培养玉米生长，然后在玉米生长的不同时期接玉米蚜，进行蚜虫的饲养繁殖，每株接蚜虫3头，次日，对没有蚜虫的植株重新接虫，从接虫后第3天开始调查蚜虫脱皮及繁殖情况、死亡数、蚜虫数，每隔3天调查一次，在植株抽雄后40天调查玉米植株的株高，用于初步确定蚜虫最佳繁殖的玉米生长时期和确定适宜玉米蚜繁殖的玉米植株生长条件。

试验结果：玉米植株的株高调查结果(以其中6株玉米植株为例)见表2所示：

表2玉米在不同光周期下的株高

玉米是短日照植物，在田间自然短日照(8～10小时)条件下可以开花结实。由上表结果可见，不同光周期对玉米的生长发育有影响，随着光照时间的增长，玉米生长发育延迟，植株显著增高。

蚜虫繁殖情况调查结果见图2及表3所示：

表3蚜虫繁殖情况调查

在玉米不同的生长时期接虫，结果发现，幼苗期玉米蚜若虫有繁殖但比较差；大喇叭口期蚜虫开始繁殖旺盛。玉米蚜分孤雌成蚜、若蚜两种，在田间自然情况下，玉米苗期平均气温低于23℃，玉米蚜主要以有翅孤雌成蚜进行为害，在玉米生长后期(生殖生长期)均温低于28℃，适宜玉米蚜繁殖，玉米蚜主要以无翅孤雌若蚜进行为害。本研究发现，在人工气候箱中，夜间温度为18℃，白天温度在25-31℃，在玉米苗期(喇叭口期以前)接的若蚜，因不适宜若虫繁殖，蜕化为有翅孤雌成蚜，在玉米大喇叭口期以后接若蚜，若蚜开始繁殖，特别是抽丝期，虫口数量迅速增加。因此，调整光周期和温度，缩短玉米营养生长期，相对延长生殖生长期，创造适宜玉米蚜若虫繁殖条件，有利于提高人工饲养繁殖玉米蚜群口量。

此外，在3种环境下均有蚜虫生长，说明25～31℃的温度范围适合蚜虫生长；光照时长在8～14小时，都有蚜虫生长，其中光照10小时为最适宜蚜虫繁殖的光照周期。

实施例2.3

玉米蚜饲养繁殖条件的确定，在初步确定玉米生长条件及玉米不同生长时期对玉米蚜繁殖影响的基础上，继续进行适宜玉米蚜繁殖的玉米生长最适光周期。

试验方法：将播种易感蚜玉米品种ph6wc的9盆试验样品，分别放于白天温度为28℃、夜间温度为20℃、湿度为70％，光照周期分别为昼/夜7小时/17小时、昼/夜10小时/14小时和昼/夜12小时/12小时，3个环境下，先培养玉米生长，然后在玉米幼苗长至2叶1心期，每株幼苗接蚜虫5头，进行蚜虫的饲养繁殖。在植株生长不同时期，调查蚜虫的数量和植株株高和叶片数，与田间自然生长的ph6wc玉米品种的生长情况比较，用于确定人工气候箱条件下适宜蚜虫繁殖的玉米生长最适光周期。

试验结果：光照周期对玉米生育期的影响结果见图3和表4所示：

表4光周期对玉米生育期的影响

与田间自然生长的玉米植株比较，生长在人工气候箱内的玉米受不同光照周期的影响其生育期有显著的改变，生长发育明显提前，生育期缩短，植株变矮，总叶片数和穗位降低。玉米植株的生殖生长提前，为蚜虫的繁殖提供了更有利条件。

3个环境下蚜虫群口数量的变化趋势见图4所示，利用人工气候箱培育活体玉米植株饲养繁殖玉米蚜试验如图5所示，结果表明玉米在光照周期昼/夜为10小时/14小时条件下最有利于蚜虫的繁殖。

本发明的玉米蚜人工饲养繁殖方法，最适蚜虫繁殖条件为:采用壤土与营养土的质量比为3:1的配方土作为玉米植株培养基质，玉米植株培养条件和玉米蚜饲养繁殖条件均为昼温28℃、夜温20℃、湿度70％、光照强度9600lx、光照10小时，玉米蚜接种期为玉米植株长至两叶一心期。

实施例三

本实施例涉及人工饲养繁殖玉米蚜的生物型dna水平和形态学鉴定，按如下步骤进行：

(1)、从不同人工气候箱和玉米田间分别收集蚜虫，放在光学显微镜下观察，从形态特征上进行鉴定。

(2)、对上述收集的蚜虫分别浸泡在无水乙醇2天(每天换一次新鲜的无水乙醇)，放置在-20℃冰箱中储存备用。

(3)、采用ctab法提取蚜虫dna：

将单头新鲜的蚜虫或无水乙醇保存的蚜虫置于吸水纸上，吸干乙醇，置于1.5ml的离心管中。在离心管中加入50μl的ctab抽提液，把移液枪的枪头(1000μl)尖端在酒精灯上烧一下后迅速插入一个1.5ml的空离心管底部待其冷却后，用其将每一管的蚜虫挑到离开液面的管壁上，然后在管壁上用此工具把蚜虫研磨至完全粉碎，再加入150μl的ctab缓冲液。将离心管放入水浴锅，65℃温浴1h。将离心管取出，加入1u的rna酶，置于37℃温箱中1h取出后，加入500μl氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，缓慢摇动混匀，13000～15000r/min离心15min。取上清液(约150μl)置于新的1.5ml离心管中。加入2倍体积的冰的无水乙醇，约1/10体积的醋酸钠(ph5.2)，混匀后置于-20℃，过夜(8h以上)。13000r/min离心15min，弃上清，用-20℃保存的70％乙醇清洗2次。室温干燥后加入20ml1×te(ph8.0)溶解，置于4℃待用或-20℃冰箱中保存。

(4)、dna的浓度和纯度检测：

选用nanodropnd-1000分光光度仪进行dna浓度和纯度的定量测定。

(5)、pcr扩增及检测：

选用lepf(5′-attcaaccaatcataaagatattgg-3′)、lepr(5′-taaacttctggatgtccaaaaaatca-3′)特异引物(lep引物为蚜虫线粒体上的coi基因的特异扩增引物)，使用thermalcyclerpcr仪对所提取的dna进行扩增检测。pcr反应体为：10×transstarttaqbuffer3μl，dntps2.4μl，lepf0.6μl，lepr0.6μl，taqdna聚合酶0.4μl，灭菌超纯水20μl，dna模板3μl。反应程序为：95℃7min；94℃1min，50℃1min，72℃1min，15循环；94℃1min，52℃1min，72℃1min，20循环；72℃10min，4℃30min。

(6)、测序：

pcr产物送北京中科希林测序部进行测序，所用测序仪器为abiprism3730xl。

试验结果：人工气候箱中收集的蚜虫在光学显微镜下观察结果见图6所示。对人工气候箱繁殖的蚜虫在显微镜下进行形态观察，结果表明若虫和有翅雌性成虫符合玉米蚜的形态特征。

分别对从3个不同环境条件的人工气候箱收集的蚜虫进行dna水平测序，结果见图7所示。结果表明，与收集的玉米田自然发生的玉米蚜相比，人工繁殖的蚜虫与田间自然环境繁殖的蚜虫dna序列相同，遗传组成一致。

综上所述，本发明的玉米蚜人工饲养繁殖方法，更接近自然状态下蚜虫感染玉米的生长繁殖过程，从而得到与自然捕获的玉米蚜具有相同生物形态特性、遗传特性等生理、生化性状的大量玉米蚜样本，为玉米蚜的研究与防治及玉米抗玉米蚜鉴定和抗性基因的准确定位克隆提供有效样本，且样本具有更稳定、更具普遍意义，不受季节变化和其它自然环境的限制，并极大减少因人为干预因素造成对蚜虫样本生物型的影响，对于蚜虫深入且精准的生物学研究，优良抗蚜玉米品种的选育具有极其重要的意义。