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东北红豆杉细胞GGPPS基因cDNA的克隆

来源：花匠小妙招时间：2025-03-25 22:03

29420128JOURNALOFNATURALSCIENCEOFHEILONGJIANGUNIVERSITYVol.29No.4August2012GGPPScDNA11112121．1500802．150500　　。RT－PCRGGPPSGGPPSpMD20－TvectorE．coliDH5α。GGPPS371bpGenBankGGPPS99%。。　　Q781A1001－7011201204－0536－052012－04－10115513771977－1973－E-mailzk395@yahoo．com．cn．GGPPScDNAJ．2012294536－540．01971Wani1Taxusbrevifoliataxol。Schiff19742、3－6、7。。8。9。10HQD3311HD1－3232.73μg·L－1327.14μg·L－1。。、12。、13－15。16。17。RT－PCRGGPPS371bp342bpGenBankGGPPS99%。。　　　www.taodocs.com　　　　　　　29420128JOURNALOFNATURALSCIENCEOFHEILONGJIANGUNIVERSITYVol.29No.4August2012GGPPScDNA11112121．1500802．150500　　。RT－PCRGGPPSGGPPSpMD20－TvectorE．coliDH5α。GGPPS371bpGenBankGGPPS99%。。　　Q781A1001－7011201204－0536－052012－04－10115513771977－1973－E-mailzk395@yahoo．com．cn．GGPPScDNAJ．2012294536－540．01971Wani1Taxusbrevifoliataxol。Schiff19742、3－6、7。。8。9。10HQD3311HD1－3232.73μg·L－1327.14μg·L－1。。、12。、13－15。16。17。RT－PCRGGPPS371bp342bpGenBankGGPPS99%。。　　　www.taodocs.com　　　　　　　

11.11.1．1TaxuscuspidataE．coliDH5αTIANGEN。1.1.218LBLBLB15g1.05kg·cm－220min50°C～60°C100μg·mL－1。1.1.3PromegaAccessRT－PCRSystemIPTGX－galPromegaDEPCTaqdNTPTaKaRapMD20－TTaKaRa。RT－PCR。1.21.2.1RNAPromegaRNAgentsTotalRNAIsolationSystem19ModifiedRNAgentsSystemProtocolRNA。A260/A280A260/A2301%RNA。1.2.2GenBankhttp//www．ncbi．nlm．nih．govGGPPScDNAPrimer15'－ATTGCAGCATGTGAGCTTGTAGGAG－3'Primer25'－TCCAGGGTTTTCAGGTCCACATTAG－3'。1.2.3RT－PCR1.2.3.1RNAcDNABioRTRNA1μL、Oligo－dT0.5μLNuclease－FreeWater4.5μLPCR70°C10min5min。PCR5×RTbuffer2μLdNTPs1μLRNaseinhibitor0.5μLAMVReverseTranscriptase0.5μL。∶48°C45min95°C5min0°C5min。1%。1.2.3.2PCRcDNAcDNAPrimer1Primer2PCR。1cycle94°C3min35cycle94°C30sec50°C30s72°C1min72°C5min4°C。1%。1.2.3.3PCRPCR2.515min4°C、12000r·min－113min0.5mLTE4°C。1.2.3.4PCRpMD20－Tvector。TakaRa4°C。1.2.3.5E．coliDH5α20。1.2.3.6PCRLB/Amp+37°C16h。12PCR。1cycle94°C1min35cycle94°C30sec62°C30sec72°C1.5min72°C7min4°C。1%。1.2.3.7。。SequencerGGPPSNCBIBLASTn。·735·4GGPPScDNA　　　www.taodocs.com　　　　　　　11.11.1．1TaxuscuspidataE．coliDH5αTIANGEN。1.1.218LBLBLB15g1.05kg·cm－220min50°C～60°C100μg·mL－1。1.1.3PromegaAccessRT－PCRSystemIPTGX－galPromegaDEPCTaqdNTPTaKaRapMD20－TTaKaRa。RT－PCR。1.21.2.1RNAPromegaRNAgentsTotalRNAIsolationSystem19ModifiedRNAgentsSystemProtocolRNA。A260/A280A260/A2301%RNA。1.2.2GenBankhttp//www．ncbi．nlm．nih．govGGPPScDNAPrimer15'－ATTGCAGCATGTGAGCTTGTAGGAG－3'Primer25'－TCCAGGGTTTTCAGGTCCACATTAG－3'。1.2.3RT－PCR1.2.3.1RNAcDNABioRTRNA1μL、Oligo－dT0.5μLNuclease－FreeWater4.5μLPCR70°C10min5min。PCR5×RTbuffer2μLdNTPs1μLRNaseinhibitor0.5μLAMVReverseTranscriptase0.5μL。∶48°C45min95°C5min0°C5min。1%。1.2.3.2PCRcDNAcDNAPrimer1Primer2PCR。1cycle94°C3min35cycle94°C30sec50°C30s72°C1min72°C5min4°C。1%。1.2.3.3PCRPCR2.515min4°C、12000r·min－113min0.5mLTE4°C。1.2.3.4PCRpMD20－Tvector。TakaRa4°C。1.2.3.5E．coliDH5α20。1.2.3.6PCRLB/Amp+37°C16h。12PCR。1cycle94°C1min35cycle94°C30sec62°C30sec72°C1.5min72°C7min4°C。1%。1.2.3.7。。SequencerGGPPSNCBIBLASTn。·735·4GGPPScDNA　　　www.taodocs.com　　　　　　　

22.1RNARNAA260/A280=1.861A260/A230=2.0671.37ng·μL－1RNA、。1%RNA28S、18S5.8S28SrRNA18SrRNA2、RNARNA。2.2PCRcDNA2371bp。2.3PCR3μL、PCRpMD20－TvectorE．coliDH5α。1∶100。2.4PCRPrimer1Primer2PCR1%PCR371bp。。2.5371bp342bpATTGCAGCATGTGAGCTTGTAGGAGGGAGTCAGGAC-CTTGCCATGCCAACTGCCTGTGCAATGGAAATGATTCATACCATGTCTCTGATTCATGATGACTTGCCCTGCATGGATAATGATGATTTCAGAAGAGGGAAGCCCACAAATCACAAGGTCTTTGGAGAGGACACTGCTGTTCTTGCAGGGGATGCCCTGCTTTCATTTGCATTTGAGCATATTGCTGTGGCTACAAGCAAGACCGTGCCTAGTGATAGGACTTTAAGGGTGATATCTGAATTGGGTAAGACAATAGGCTCTCAAGGGCTTGTAGGGGGACAGGTGGTTGATATTACATCCGAGGGGGATGCTAATGTGGACCTGAAAACCCTGGA·835·29　　　www.taodocs.com　　　　　　　22.1RNARNAA260/A280=1.861A260/A230=2.0671.37ng·μL－1RNA、。1%RNA28S、18S5.8S28SrRNA18SrRNA2、RNARNA。2.2PCRcDNA2371bp。2.3PCR3μL、PCRpMD20－TvectorE．coliDH5α。1∶100。2.4PCRPrimer1Primer2PCR1%PCR371bp。。2.5371bp342bpATTGCAGCATGTGAGCTTGTAGGAGGGAGTCAGGAC-CTTGCCATGCCAACTGCCTGTGCAATGGAAATGATTCATACCATGTCTCTGATTCATGATGACTTGCCCTGCATGGATAATGATGATTTCAGAAGAGGGAAGCCCACAAATCACAAGGTCTTTGGAGAGGACACTGCTGTTCTTGCAGGGGATGCCCTGCTTTCATTTGCATTTGAGCATATTGCTGTGGCTACAAGCAAGACCGTGCCTAGTGATAGGACTTTAAGGGTGATATCTGAATTGGGTAAGACAATAGGCTCTCAAGGGCTTGTAGGGGGACAGGTGGTTGATATTACATCCGAGGGGGATGCTAATGTGGACCTGAAAACCCTGGA·835·29　　　www.taodocs.com　　　　　　　

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第 29 卷第 4 期黑龙江大学自然科学学报 Vol. 29 No. 4
2012 年 8 月 JOURNAL OF NATURAL SCIENCE OF HEILONGJIANG UNIVERSITY August,2012
东北红豆杉细胞 GGPPS 基因 cDNA 的克隆
王歆1 , 肖野1 , 刘丹1 , 李秀凉1,2 , 赵凯1,2
, ,
1. 黑龙江大学生命科学学院微生物黑龙江省高校重点实验室哈尔滨 150080 2. 黑龙江大学农业微生物技术
,
教育部工程研究中心哈尔滨 150500

摘要牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶是红豆杉细胞紫杉醇生物合成途径中的关键酶。试
验采用 RT - PCR 技术从东北红豆杉中克隆 GGPPS 基因片段,将 GGPPS 基因片段与 pMD20 - T
, , ,
vector 连接转化 E. coli DH5α对阳性克隆进行序列测定。生物信息学分析结果表明获得 GGPPS
基因片段长度为 371 bp,与 GenBank 中收录的 GGPPS 同源性达到 99% 。为从内生真菌紫杉醇生
物合成途径中克隆关键酶基因和高产紫杉醇基因工程菌株的构建提供了借鉴。

关键词红豆杉紫杉醇牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶

中图分类号 Q781 文献标志码 A 文章编号 1001 - 7011 2012 04 - 0536 - 05
0 引言
[]
, 1
1971 年 Wani 等从短叶红豆杉 Taxus brevifolia 中分离到三环二萜类化合物紫杉醇 taxol。自 Schiff 等
[] [ ]
2 , 3 - 6
1974 揭示了紫杉醇的抗癌作用机理以来相继发现紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌等多种癌症都有显著
[]
, 7
的治疗效果同时对风湿、老年性痴呆等多种疑难杂症也有一定的治疗潜力。由于从红豆杉树分离提取
, ,
紫杉醇的量很少加之红豆杉树属于珍惜保护植物因此科学家们已开始拓展其它生产紫杉醇的途径。尽管
[]
, 8
也有模拟紫杉醇活性中心设计药物代替昂贵的紫杉醇治疗癌症但效果欠佳。紫杉醇的合成途径相当的
复杂,使得化学合成法及细胞培养法收效甚微,微生物发酵法虽然开辟了一条崭新的获取紫杉醇药源的途
[]
, , 9
径但是原始菌种产量极低而且目前国内外发酵工业中所使用的菌种大多数都是人工诱变选育得到的。
[ ] [ ]
周东坡等 10 利用紫外线等对紫杉醇产生菌进行诱变,得到一株紫杉醇高产菌株赵凯等 11 利用紫外
HQD33
线和亚硝基胍对紫杉醇产生菌孢子进行诱变,获得高产诱变菌株,其产量从初始的- 1 提
HD1 - 3 232. 73 μg·L
高至 327. 14 μg·L - 1 。
现在,工业菌株的选育已由传统的诱变选育向利用基因工程育种和代谢工程定向选育高产菌株方向转
变。合理的方法是运用分子生物学手段改造紫杉醇合成过程中的基因表达、转录因子及关键酶基因获得高
[ ] [ ]
12 , 13 - 15
产紫杉醇。近年来红豆杉属植物细胞生物合成紫杉醇的一些关键酶已被分离、鉴定及克隆。将红
豆杉细胞紫杉