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一种云南猫须草的组织培养繁殖方法及用途与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-02-26 04:31

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及一种云南猫须草的组织培养繁殖方法及用途。

背景技术：

猫须草是唇形科肾茶属多年生草本植物。猫须草产于东南亚至澳大利亚的热带亚热带地区,在我国主要分布于广东、海南、云南南部、广西南部、台湾及福建等地。中国南部地区均有生长，而北方较少见，猫须草对急慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石、风湿性下肢关节炎等有特殊疗效，并兼具抗菌消炎、抗过敏及抗慢性肾衰竭，增加肾、肝、脾血流量等功能，中国民间用其治病保健有着悠久的历史。然而由于猫须草野生药材资源日趋枯竭，但由于猫须草结果率低,种子寿命只有15d,发芽率仅为40%,传统生产繁殖方式难以满足市场需求。猫须草作为一种具有巨大开发前景的植物，组培快繁的报道很有限，目前尚未建立公认的完整组织培养体系，因此猫须草的离体快速繁殖成为大量繁殖猫须草种苗的有效途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种云南猫须草的组织培养繁殖方法。利用本发明的方法对云南猫须草进行大规模繁殖，以解决云南南猫须草结果率低,种子寿命短，发芽率低，天然状态下繁殖困难以及云南猫须草资源日益匮乏等问题，实现猫须草的猫须草的离体快速繁殖及满足大规模人工种植的需求。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种云南猫须草的组织培养繁殖方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1)配制培养基：方法中用到的基本培养基和其它各阶段组培培养基各组分的每升的含量为：

基本培养基：用ms培养基，附加白糖25-40g/l，琼脂6-8g/l，用2%氢氧化钠或1n盐酸调节ph5.8-6.0；

愈伤组织诱导培养基：ms中添加6ba1.5-4mg/l和naa0.1-1mg/l；

增殖培养基：ms中添加6ba0.1-0.5mg/l和naa.01-2.0mg/l；

分化培养基：ms中添加6-ba0.25-0.5mg/l+naa0.1mg-2mg/l；

生根培养基：ms中添加naa2.0-4.0mg/l；

配好各阶段培养基后，用2%氢氧化钠或1n盐酸调节ph5.8-6.0；分装在组织培养瓶中，121℃高压灭菌20min,室温冷却至凝固；

（2）猫须草的种植及外植体的消毒：从云南西双版纳野外采集的猫须草枝条，种植于2：1营养土：蛭石（v/v）花盆中，15天后待长出新的幼嫩叶片备用；剪取5-10片叶片，放入干净的培养瓶中，加入蒸馏水与白猫洗洁精，在摇床上摇洗，100转/min30min；然后用蒸馏水洗净洗涤液，去除多余水分；在超净台中，用75%乙醇轻轻摇晃洗涤叶片30-60s，用无菌水将乙醇洗净；将叶片放入0.1%（w/w）氯化汞溶液中，轻轻摇晃，洗涤8min；用无菌水洗涤叶片4次，放置于已灭菌干净培养皿中的滤纸上待用;

（3）猫须草愈伤组织的诱导：在超净台内，用镊子夹起已消毒完毕的外植体叶片，把叶片损伤部分剪去；用剪刀轻微剪除叶缘，创造叶片伤口，再将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小；用镊子将剪好叶片分别放入ms中添加6ba1.5-4mg/l和naa0.1-1mg/l愈伤诱导培养基中，该培养基事先配好并在121℃下灭菌20min，室温下冷却的培养基,每瓶3-5片，将培养瓶口灼烧灭菌并盖好瓶盖；将培养瓶放入暗处暗培养2-4周，温度24℃；

（4）猫须草愈伤组织的增殖：原代培养30天，在超净台内，用灭菌的镊子将愈伤组织块从旧的培养瓶中夹出，愈伤组织块较大的，用刀片将其切开，使每块组织大小为0.5cm×0.5cm，接入新鲜的ms+6-ba0.10mg-0.5mg/l+naa1mg-2mg/l培养基上，121℃高压灭菌20min,进行继代培养；将转接后的猫须草愈伤组织放在光下培养，光照强度3000lux，温度24℃，光照16h，黑暗8h；

（5)猫须草愈伤组织的分化：步骤3培养30天后，愈伤组织进行了大量的增殖，将增殖的愈伤组织移至ms+6-ba0.25mg/l(或0.5mg/l)+naa0.1mg/l，121℃高压灭菌20min分化培养基上使其分化出芽；

（6)生根培养：将增殖形成的丛芽块切成一个个单芽，移至生根培养基ms中添加naa2mg-4mg/l培养基上，121℃高压灭菌20min，每瓶培养基放3-5个单芽，在生根培养基中进行生根培养15-20天；

（7）练苗：当生根培养基中的小苗，根长至2厘米长、根数3-5条时进行开盖练苗3-5天，此时根正在生长旺盛时成活率较高；

（8）移栽：练苗3-5天后，将苗从组培瓶取出，用清水洗两遍后，再用多菌灵浸泡20min移栽入基质中，在温室中培养至成。

苗云南猫须草组织培养繁殖技术，包括以下步骤：

本发明云南猫须草组织培养快速繁殖方法更加详细的步骤为：

（1)配制培养基，基本培养基和其它各阶段组培培养基各组分的每升的含量为：

基本培养基：用ms培养基，附加白糖25-40g/l，琼脂6-8g/l，用2%氢氧化钠或1n盐酸调节ph5.8-6.0；

愈伤组织诱导培养基：ms中添加6ba1.5-4mg/l和naa0.1-1mg/l；

增殖培养基：ms中添加6ba0.1-0.5mg/l和naa.01-2.0mg/l；

分化培养基：ms中添加6-ba0.25-0.5mg/l)+naa0.1mg-2mg/l；

生根培养基：ms中添加naa2.0-4.0mg/l；

配好各阶段培养基后，用2%氢氧化钠或1n盐酸调节ph5.8-6.0；分装在组织培养瓶中，121℃高压灭菌20min,室温冷却至凝固。

（2）野外猫须草材料的种植及叶片的消毒：从云南西双版纳野外采集的猫须草枝条，种植于花盆中，待长出新的幼嫩叶片备用。剪取5-10片叶片，放入干净的培养瓶中，加入适量蒸馏水与白猫洗洁精，在摇床上摇洗30min；洗完后用蒸馏水洗净洗洁精，去除多余水分；在超净台中，用70-75%乙醇轻轻摇晃，洗涤叶片30-60s，用无菌水将乙醇洗净；将叶片放入0.1%-1%氯化汞溶液中，杀菌8-10min；用无菌水洗涤叶片4-6次，放置于干净培养皿中的滤纸上。

（3）云南猫须草愈伤组织的诱导在超净台内，将剪刀镊子置于酒精灯上方充分灼烧灭菌，置于干净培养皿上冷却；用镊子夹起上述已消毒好的外植体叶片，用剪刀将叶片损伤部分剪去；再用剪刀轻微剪除叶缘，人工创造叶片伤口，再将叶片剪成适当大小（一般5mmx5mm）；用镊子将剪好叶片分别放入事先配好的ms中添加6ba0.25-4.0mg/l和naa0.1-2.0mg/l的愈伤诱导培养基中，每瓶3-5片，将培养瓶口灼烧灭菌并盖好瓶盖；将培养瓶放到25℃条件下，暗处暗培养2-4周。

（4）猫须草愈伤组织的增殖：原代培养30d左右，在超净台内，用灭菌的镊子将愈伤组织块从旧的培养瓶中夹出，愈伤组织块较大的，用刀片将其切开，使每块组织大小约为0.5cm×0.5cm，接入新鲜的ms+6-ba0.10mg-0.5mg/l+naa1mg-2mg/l培养基上,进行继代培养。将转接后的猫须草愈伤组织放在光下培养，温度23-25℃，光照强度2000-3000lux，光照时间16h，黑暗培养/8h，培养30d左右。

（5）猫须草愈伤组织的分化：将步骤3已诱导形成愈伤组织，在无菌超净台上用手术刀将愈伤组织切成0.5cm左右的大小，移至ms+6-ba0.25mg/l(或0.5mg/l)+naa0.1mg/l分化培养基上，使其分化出芽。

（6）猫须草芽的生根培养：将增殖形成的丛芽块切成一个个单芽，移至生根培养基ms中添加naa2-4mg/l培养基上，每瓶培养基放3-5个单芽，在生根培养基中进行生根培养15-20d左右；

（7）练苗：当生根培养基中的小苗，根长至2厘米长、根数3-5条时进行开盖练苗3-5d，此时根正生长旺盛，移栽后成活率较高。

（8）移栽：练苗3-5天后，将苗从组培瓶取出，用清水洗两遍将培养基洗净，再用多菌灵浸泡10-20min移栽入营养土：蛭石2：1混合的基质中，在温室中缓苗15-20d后，进行大田移栽，成活率为95%。

本发明进一步公开了云南猫须草的组织培养繁殖方法在用于猫须草的离体快速繁殖方面的应用。本发明是利用野生云南猫须草的幼叶进行大规模快速繁殖猫须草幼苗，方法是以野外采集的云南猫须草叶片为外植体进行愈伤组织诱导，通过分化、增殖、生根使其再生出植株。本发明的愈伤产生芽和根的分化率可达90％以上，苗移栽成活达95％以上。通过大规模组培繁殖猫须草，可以使猫须草种植面积扩大几百倍，满足了市场的需求，推动了猫须草产业快速的发展。

附图说明

图1云南猫须草野生材料在室内的栽培；

图2云南猫须草嫩叶在初始增殖培养基中脱分化、增殖形成愈伤组织；

图3云南猫须草叶片愈伤组织在分化培养基中的诱导分化培养形成不定芽及幼苗；

图4云南猫须草幼苗在根诱导培养基中的诱导生根分化培养；

图5云南猫须草小苗在生根培养基中生长的幼苗；

图6云南猫须草小苗练苗及移栽。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

原料来源：

实施例1

（1）猫须草的种植及外植体的消毒从云南西双版纳野外采集的猫须草枝条，种植于含有2：1营养土：蛭石花盆中，15天后待长出新的幼嫩叶片备用（图1）。剪取10片叶片，放入干净的培养瓶中，加入适量蒸馏水与白猫洗洁精，在摇床上摇洗（100转/min）30min；然后用蒸馏水洗净洗涤液，去除多余水分；在超净台中，用75%乙醇轻轻摇晃洗涤叶片45s，用无菌水将乙醇洗净；将叶片放入0.1%氯化汞溶液中，轻轻摇晃，洗涤8min；用无菌水洗涤叶片4次，放置于已灭菌干净培养皿中的滤纸上待用。

（2）猫须草愈伤组织的诱导：在超净台内，将剪刀、镊子置于酒精灯上方充分灼烧灭菌，置于干净培养皿上冷却；用镊子夹起已消毒完毕的外植体叶片，把叶片损伤部分剪去；用剪刀轻微剪除叶缘，创造叶片伤口，再将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小；用镊子将剪好叶片分别放入ms中添加6ba1.5mg/l和naa0.1mg/l愈伤诱导培养基中（图2），该培养基事先配好并在121℃下灭菌20min，室温下冷却的培养基。每瓶4片，将培养瓶口灼烧灭菌并盖好瓶盖；将培养瓶放入暗处暗培养4周，温度24℃。

（3）猫须草愈伤组织的增殖：原代培养30天左右，在超净台内，用灭菌的镊子将愈伤组织块从旧的培养瓶中夹出，愈伤组织块较大的，用刀片将其切开，使每块组织大小约为0.5cm×0.5cm（图3），接入新鲜的ms+6-ba0.5mg/l+naa1mg/l培养基上（121℃高压灭菌20min）,进行继代培养。将转接后的猫须草愈伤组织放在光下培养，光照强度3000lux，温度24℃，光照16h，黑暗8h。

（4)猫须草愈伤组织的分化：步骤3培养30天后，愈伤组织进行了大量的增殖，将增殖的愈伤组织移至ms+6-ba0.25mg/l(或0.5mg/l)+naa0.1mg/l（121℃高压灭菌20min）分化培养基上使其分化出芽（图4）。

（5)生根培养：将增殖形成的丛芽块切成一个个单芽，移至生根培养基ms中添加naa2mg-4mg/l培养基上（121℃高压灭菌20min），每瓶培养基放3-5个单芽，在生根培养基中进行生根培养20天（图5）；

（6）练苗：当生根培养基中的小苗，根长至2厘米长、根数5条时进行开盖练苗4天，此时根正在生长旺盛时成活率较高（图6）。

（7）移栽：练苗4天后，将苗从组培瓶取出，用清水洗两遍后，再用多菌灵浸泡20min移栽入基质中，在温室中培养至成苗（图6）。从图中可以看到90%以上移栽的小苗都已成活且生长旺盛。

实施例2

（1）愈伤组织的诱导：将步骤（5）生根培养的小苗，在无菌超净台下，将生长出来的叶片剪成0.3cm×0.3cm大小，用镊子将剪好叶片分别放入ms中添加6ba2.0mg/l和naa0.3mg/l愈伤诱导培养基中（图2），每瓶3-5片，将培养瓶口灼烧灭菌并盖好瓶盖；将培养瓶放入暗处暗培养20d，温度24℃。

（2）猫须草愈伤组织的增殖：原代培养30天左右，在超净台内，用灭菌的镊子将愈伤组织块从旧的培养瓶中夹出，愈伤组织块较大的，用刀片将其切开，使每块组织大小约为0.5cm×0.5cm（图3），接入新鲜的ms+6-ba1mg/l+naa0.5mg/l培养基上（121℃高压灭菌20min）,进行继代培养。将转接后的猫须草愈伤组织放在光下培养，光照强度3000lux，温度24℃，光照16h，黑暗8h。

（3)猫须草愈伤组织的分化：步骤3培养30天后，愈伤组织进行了大量的增殖，将增殖的愈伤组织移至ms+6-ba0.5mg/l+naa0.5mg/l（121℃高压灭菌20min）分化培养基上使其分化出芽（图4）。

（4)生根培养：将增殖形成的丛芽块切成一个个单芽，移至生根培养基ms中添加naa3mg/l培养基上（121℃高压灭菌20min），每瓶培养基放3个单芽，在生根培养基中进行生根培养20天左右（图5）；

（5）练苗：当生根培养基中的小苗，根长至2厘米长、根数3-5条时进行开盖练苗5d，此时根正在生长旺盛时成活率较高（图6），从图中可以看到小苗生长旺盛，死苗率较低，完全可以移栽到大田进行生产。