晶研谈 | 单晶培养之熔融微滴法
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晶研谈是由晶泰科技发起的药物固态研究交流专栏，旨在与学术专家及业界同行就药物固体形态研究中的问题与挑战进行深入交流，分享最新研究进展，讨论前沿创新技术，探索有效解决方案，共同促进国内药物固体形态研究的发展及繁荣。
一、研究背景
所有的化学研究都需要结构信息。单晶 X 射线衍射分析(SCXRD)是阐明分子结构和研究晶体形态的通用方法。目前的单晶 X 射线衍射分析需要利用重结晶手段，培养得到可以用于解析的高质量晶体样品。如何在较短时间内培养合格单晶目前在实验上仍然具有挑战性，且需要尝试多种常规结晶条件，并且获得高质量晶体的总体成功率较低。
在多种结晶条件中，利用熔融结晶满足单晶 X 射线衍射分析的晶体样品有其优越性。这主要是因为熔体中较高的分子浓度会产生比溶液中更高的成核热力学驱动力，促进亚稳晶型晶核的形成。这些晶核可以转变为更稳定的晶型或交叉成核快速生长为多晶，显示出更多的晶型，有助于发现新的固体形态。但常规的熔融结晶也有其弊端，比如制备的晶型有时会产生质量差的多晶(如球晶)，不适合单晶 X 射线衍射进行结构解析。
如何利用熔融法既可以产生更大的结晶推动力，同时又可以提高晶体样品质量满足解析要求，是目前该方法工业化应用的主要难点。近些年，工业界通过改良原有技术，形成了熔融微滴法培养单晶，在单晶培养解析的实验技术方面取得了一定突破。
二、熔融微滴法培养单晶的方法与案例
熔融微滴法培养单晶是从熔融微滴中迅速收获单晶的一种方法，能够在数十分钟内从微米级的熔化微滴中快速培养单晶的一种手段。要从熔体微滴中生长出单晶，可以将多晶材料部分熔化，直到只剩下一个单晶种子为止，然后，让种子在低于熔点(通常为 0.97-0.99 Tm，Tm 为熔点)的孤立微滴中生长，以避免二次成核和其他晶体的干扰[1]。
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图1 熔融微滴法培养单晶示意图
案例 1
灰黄霉素是一种经典抗真菌药物，在 1977 年报道了第一个晶体结构（Form I，稳定晶型），36 年后，通过熔融结晶发现了两个亚稳态的晶型（Form II 和 Form III），在 2018 年获得了 Form II 的晶体结构。但灰黄霉素 Form III 总是在不同温度下生长为多晶球晶，经常受到快速生长的 Form I 干扰缺失结构信息。利用融熔微滴法可快速获得灰黄霉素 Form III 的单晶。
为了生长灰黄霉素 Form III 的单晶，将灰黄霉素粉末在 222 ºC下熔化，然后淬火至室温，再在 110 ºC下等温结晶 48 h，触发灰黄霉素 Form III 成核。经过试验表明，加入 10%wt 聚乙二醇可以使 Form III 的成核诱导时间缩短到 30 min 以内，但这将提高 Form I 的成核概率。一旦出现小的灰黄霉素 Form III 球晶，使用不锈钢针将 Form III 种子引入到 180 ºC的熔体液滴中，可获得纯的灰黄霉素 Form III。然后在 205 ºC下将少量 Form III 样品部分熔化，在孤立的熔体微滴中留下一颗晶种，然后在 200 ºC下等温生长。高的生长温度避免了二次成核，同时孤立的微滴保护晶种不受其他晶体的干扰，从而可以得到 Form III 单晶。
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图 2 灰黄霉素的(a)球晶，(b)单晶体
案例 2
近年来，在晶体形态的实验发现和理论预测方面取得了重大进展，但计算预测通常会产生比实验发现所得的晶型多。目前尚不清楚是对不合理结构的去除不够充分，还是由于缓慢成核、缓慢生长、不稳定或其他因素而未能观察到某些形态，还是两者兼得。
烟酰胺是一种天然形式的维生素 B3，对其多晶型的研究始于 1943 年，但只发现了两个多晶型结构（Form α 和 Form β）。对非手性有机晶体中最常见的空间群（Z' = 1 的 11 个空间群和 Z' = 2 的 6 个空间群）进行了晶体结构预测，得到了 124 个热力学合理结构。
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图 3 晶体结构预测结果，熔体结晶发现了 6 个结构，并用菱形符号作为标记。利用 optPBE-vdw 函数进行优化和评估，在图中也用点标记了 2 个 Z' = 4 的结构(Form β 和 Form γ)和 1 个 Z' = 20 的结构((Form θ)
近期研究报道[2]，通过熔体结晶得到了7种溶液结晶所不能获得的烟酰胺新晶型（Form γ-ι）。Form α 是最稳定的晶型，它的结晶速度非常快，一旦出现晶核就会迅速消耗剩余的熔体，并触发任何亚稳态晶相转变为 Form α。Form δ、Form ε、Form η 和 Form θ 在一定的温度区域可在熔体中自成核。Form β 和 Form γ 由较不稳定的 Form γ 和 Form θ 固-固相转变自发成核。Form ζ 可在 Form γ 或 Form δ 表面交叉成核。Form ι 可通过在熔体边缘引入异烟酰胺的晶种触发成核。
利用熔体结晶得到的晶种通过熔融微滴法获到包括两种已知晶型（Form α 和 Form β）在内的 9 种不同晶型的单晶，其中包含 2 个 Z' = 4 的单晶结构(Form β 和 Form γ)和 1 个 Z' = 20 的单晶结构(Form θ)，部分熔融温度和晶体生长温度如下表所示。
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图 4 熔融微滴法培养的烟酰胺不同晶型的单晶体
表1 烟酰胺不同晶型单晶体的培养条件
Polymorph
Partial melting temperature(ºC)
Cultivation temperature(ºC)
TCultivation
/TMelting
Form α
129
127
Form β
110
Form γ
115
110
Formδ
114
Form ε
108
Form ζ
108
Form η
108
106
Form θ
102
Form ι
103
95
小结：
熔融微滴法培养单晶是对溶液法的理想补充，可快速培养微量单晶用于结构测定。能够在多晶型研究、药物研发、天然产物化学和有机合成化学等领域得到应用，用少量的原料进行高效的结构确定。但熔融法不适用于熔融温度高于分解温度的化合物的单晶培养（如盐和共晶），只适用于游离态的无水晶型，有一定的局限性。
参考文献：
[1] Ou X, Li X, Rong H, et al. A general method for cultivating single crystals from melt microdroplets[J]. Chemical Communications, 2020, 56.
[2] Li X, Ou X, Wang B, et al. Rich polymorphism in nicotinamide revealed by melt crystallization and crystal structure prediction[J]. Communications Chemistry, 2020, 3(1):152.
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