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纳升级液相色谱—串联质谱法分析毛白杨次生维管系统及其再生过程的蛋白质表达谱

来源：花匠小妙招时间：2025-02-15 13:11

纳升级液相色谱—串联质谱法分析毛白杨次生维管系统及其再生过程的蛋白质表达谱

【摘要】：木材形成是一个复杂的生物学过程,涉及大量木材形成相关基因在维管形成层中的有序表达。在复杂的表达途径中,相较于mRNA而言,蛋白质直接参与或调节生物的形态建成,更能体现基因的表达特性及其在生物体中的功能,因此,对木本植物维管形成层蛋白质表达谱的深入研究有助于揭示木材形成过程中的相关基因及其功能。本课题组建立的毛白杨(Populus tomentosa)次生维管再生系统能模拟维管形成层细胞发生和分化等一系列过程。基于该系统,对其再生过程进行分阶段取样,并对各阶段样品进行总蛋白提取、一维凝胶电泳分离和酶解,并对获得的肽段进行nanoLC-ESI-MS/MS分析,获得了毛白杨正常发育及再生次生维管系统的蛋白质表达谱。经鉴定,共获得了1467个在毛白杨次生维管系统及其再生过程中表达的非冗余蛋白,其功能涉及细胞周期控制及细胞分裂、细胞壁及膜的发生、转录因子和信号转导等23个类别,其中氨基酸运输与代谢类、碳水化合物运输与代谢类、能量产生与转化类、翻译与核糖体发生类以及翻译后修饰与伴侣蛋白类蛋白质是整个蛋白质组的主要成分。此外,占总鉴定数13%的蛋白功能未知。所获得的1467个蛋白的等电点主要分布于4-7的酸性区间(71%)和7-11的碱性区间(28%),与本课题组之前进行的蛋白质组分析结果相比,有效地提高了碱性蛋白的鉴定。在鉴定的1467个非冗余蛋白中,207个仅在正常发育的次生维管系统中表达,592仅在次生维管系统再生过程中表达,其余668个在次生维管系统正常发育及再生过程中均有表达,充分说明了正常发育条件下与再生过程中的次生维管系统之间蛋白质表达的相似性和差异性。本课题组已有的组织观察结果表明,剥皮导致毛白杨次生维管系统在未成熟木质部区域分离,使韧皮部和形成层及少量未成熟木质部附着于树皮一侧(D0B),而大量未成熟木质部保留在树干一侧(D0S)。针对两侧幼嫩组织的蛋白质组分析共鉴定了875个非冗余蛋白,其中380个蛋白特异表达于D0B中,216个蛋白特异表达于DOS中,而其余279个蛋白则在两侧具有表达。该蛋白质组分上的差异充分表明了次生维管系统中不同细胞类型的蛋白质表达水平变化。在毛白杨次生维管系统再生过程中,从剥皮后2天开始,树干表面未成熟木质部中的射线细胞分裂形成大量愈伤组织,逐步产生不连续和连续的分生组织细胞,之后形成连续、规则的维管形成层,经形成层分化,至22天时形成完整的木材形成结构。在该再生过程中,发生大量细胞分裂和分化等活动,涉及基因的复制、转录及翻译等多个环节的调控。本研究共鉴定并初步分析了转录因子及转录调节活动相关蛋白30个(其中包括ATHB-15、LIM类、NAC类等已经大量报道的转录因子)；有关细胞周期和细胞分裂控制相关的蛋白16个(其中包括CDC48、RAN、GRP2等重要的细胞周期调节因子)；细胞骨架有关的非冗余蛋白25个(其中包括微管蛋白及微管相关蛋白、驱动蛋白、肌球蛋白和分泌粒蛋白等)；约60个信号转导相关蛋白(包括生长素信号途径相关蛋白、钙调素和G蛋白等)以及近40个细胞壁成分蛋白或合成调节蛋白。此外,本研究将部分鉴定蛋白与基于同一系统的转录组分析和实时定量PCR验证结果进行了对比。在对比分析的三个基因所对应的蛋白质中,仅有1个的蛋白质表达趋势与转录组分析和实时定量PCR验证基本一致,其余两个基因的蛋白质表达鉴定与转录组分析和实时定量PCR验证结果存在阶段差异。这可能与转录水平的选择性或可变剪接有关,也可能与蛋白质的翻译后修饰以及不同鉴定方法的检测限有关。针对毛白杨发育中的次生维管组织蛋白质样品,本研究建立了一套基于1DE的nanoLC-ESI-MS/MS在线分离鉴定技术体系,鉴定了大量可能参与木材形成的相关蛋白,这些蛋白的编码基因可以作为分离、鉴定调控木材形成关键基因的候选基因,并开展进一步的功能验证,为木材材性改良的基因工程育种提供理论基础及基因资源。

【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010

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