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番茄青枯病抗性鉴定方法

来源：花匠小妙招时间：2025-02-13 02:34

专利名称：番茄青枯病抗性鉴定方法
技术领域：
本发明属于蔬菜抗病性鉴定技术领域，尤其是属于番茄青枯病抗性鉴定的一种方法。
背景技术：
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)起源于南美洲和墨西哥，是世界上最重要的茄科作物之一。由于长期连作和土壤酸化的影响，青枯病(Ralstoniasolanacearum E.F.Smith)严重限制了番茄在热带和亚热带地区的生产，因此，番茄抗病品种的选育与引进是对青枯病综合防治的重要措施之一，但由于青枯病致病菌—假单孢杆菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)其基因的多样性和寄主范围的广泛性，以及对番茄材料或品系进行抗性鉴定方法本身还存在有缺陷，这在一定程度上限制了对青枯病的控制。因此，准确有效的抗性鉴定方法对番茄抗性材料的鉴定和抗病品种的选育是至关重要的。
在以往青枯病抗性材料的鉴定中，一般采用苗期接种鉴定和/或病圃抗性鉴定，主要根据青枯病的发病病症——植株的萎蔫率来确定材料的抗性水平。其中，病圃抗性鉴定主要应用于番茄成株鉴定，其鉴定结果易受地块细菌浓度的均匀性及其气候影响，导致不同年份之间的鉴定结果存在一定的差异，而且病圃鉴定也因面积有限，无法同期对大批量的材料进行抗性鉴定；苗期接种鉴定在一定程度上克服了病圃鉴定的局限性，但在应用过程中由于接种苗龄、接种方法、病菌的株系以及培养环境的不同，鉴定结果往往也不一致；上述两种鉴定结果只是反映了番茄苗期或成株期对青枯病菌的耐受能力，而并非是该品种或材料的真正抗性水平，因为在番茄的种植过程中往往还存在有潜性感染现象，即青枯菌(假单孢杆菌)通过植株根部的伤口，入侵植株后在茎杆等维管束内不断扩繁延伸，只有当植株内假单孢杆菌群体数超过108cfu，植株才表现出萎蔫症状；同时，不同的抗性材料对抑制假单孢杆菌扩繁延伸的能力也是不同的，所以不表现出萎蔫症状的植株不一定就不感染假单孢杆菌，故单纯依靠植株病症表现来判断，还无法真实评价出不同材料的抗性水平。

发明内容
本发明目的是克服上述已有技术的不足之处，提出一种在以往番茄苗期和成株期对青枯病耐受能力鉴定基础上，进一步结合青枯病潜在感染以及菌系与寄主植物的互作关系，即假单孢杆菌在植株体内数量及群体分布的检测结果，综合评价番茄材料抗青枯病水平的抗病鉴定方法，提高抗性鉴定的准确程度，以加速番茄抗青枯病新品种的选育或引进抗病品种的筛选与推广应用。
本发明目的通过如下技术方案得以实现一种番茄青枯病抗性鉴定方法，按以下步骤进行(1)番茄苗期接种鉴定①采用常规育苗方法，培育生长基本一致的番茄苗，至5-6叶时备用；②以LB培养基接种假单孢杆菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)进行扩繁培养；将扩繁后的假单孢杆菌用无菌水稀释至浓度为108cfu/ml的细菌悬浮液；该悬浮液的OD(A600)值等于0.4；③番茄苗伤根接种，每株接菌种悬浮液30ml；④接种苗在气温25-30℃，土壤相对湿度60％以上条件下培育管理；⑤接种后7天开始调查统计植株萎蔫率，每7天调查一次，共调查4次，汇总后进行番茄苗期抗性鉴定评价；(2)番茄植株内假单孢杆菌群体及其分布检测
①苗期接种抗性鉴定结束后，将未萎蔫植株经冲洗、拭干、75％酒精消毒后，把茎段截取成0-2、2-4、4-6、6-8、8-10cm长度；②分别将各茎段置于10ml无菌水中，在30℃条件下培养，2h后获得细菌悬浮液；③将各茎段细菌悬浮液稀释至该假单孢杆菌的典型菌落在培养基上能清晰明显，易于统计为标准，从中取0.1ml稀释液于TZC选择培养基上推成平板，在30℃，RH＝60％条件下培养24-48h；④统计各培养基上形成的红色菌落，得出假单孢杆菌在各番茄试材植株内群体的大小及其分布情况，汇总后进行参试材料的抗性评价；(3)病圃抗性鉴定①将历年青枯病发病病圃作为青枯病鉴定病圃；②将步骤(2)获得的抗病材料的种子，培育成生长一致的番茄苗后定植于病圃内；③调查统计植株萎蔫率，进行番茄生长结果期的抗性鉴定；(4)根据番茄各试材(1)苗期接种鉴定和(2)植株内假单孢杆菌群体大小及其分布检测与(3)病圃抗性鉴定的结果，进行综合评价，划定抗性水平。
所述的TZC选择培养基中TZC的浓度为50mg/L，余量为LB培养基。
本发明在传统的番茄苗期接种鉴定和成株病圃抗性鉴定的基础上，科学地在两阶段之间增加了植株内假单孢杆菌群体大小及其分布的检测，使番茄苗期或成株期对青枯病菌外在表现的耐受能力与植株内在感染病菌的程度及其抑制假单孢杆菌在体内扩繁延伸的能力有机地结合起来，进行综合评价，划定抗性水平，从而显著提高了对参试材料抗番茄青枯病的准确水平(见表1)。

图1假单孢杆菌TTS小种接种后番茄不同品系、不同茎段假单孢杆菌菌落群体的变化曲线图具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述。
实施例1试验材料番茄品种85254、51255、47254、7585、51198、519230、1466EA、203和85198共9个品种；其中1466EA和203分别作为抗病对照和感病对照。
番茄青枯病菌源假单孢杆菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)TT4小种；(浙江省农科院蔬菜所分离出的青枯病番茄致病菌，属于假单孢杆菌race1，biovar 3)。
TZC选择培养基配方LB培养基+TZC 50mg/l。
LB培养基配方蔗糖10g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1L。
试验于2002年11月-2003年7月在浙江省农科院蔬菜所试验基地进行；一种番茄青枯病抗性鉴定方法，按以下步骤进行(1)番茄苗期接种鉴定①采用常规育苗方法，将种子播于装有营养基质的10cm的营养钵，培育生长基本一致的番茄苗，至5-6叶时备用；②以LB培养基接种假单孢杆菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)进行扩繁培养；将扩繁后的假单孢杆菌用无菌水稀释获得细菌悬浮液，并根据细菌悬浮液的OD值调节细菌的浓度，使最终获得的细菌悬浮液的OD(A600)值等于0.4(细菌浓度相当于108cfu/ml)；③接种时离根基部2cm处用刀自上而下向基质内切2刀，伤及部分根系，再在每个营养钵内倒入30ml的细菌悬浮液(OD(A600)＝0.4)，以确保同等的细菌浓度；④接种苗在气温25-30℃，土壤相对湿度60％以上条件下栽培管理；⑤接种后7天开始调查统计植株萎蔫率，每7天调查一次，共调查4次，汇总统计病情指数和植株萎蔫率，进行番茄苗期抗性鉴定评价；(2)番茄植株内假单孢杆菌群体及其分布检测①苗期接种抗性鉴定结束后，将未萎蔫植株经冲洗、拭干、75％酒精消毒后，把茎段截取成0-2、2-4、4-6、6-8、8-10cm长度；②分别将各茎段置于10ml无菌水中，在30℃条件下培养，2h后获得细菌悬浮液；③将各茎段细菌悬浮液稀释至该假单孢杆菌的典型菌落在培养基上能清晰明显，易于统计为标准，从中取0.1ml稀释液于TZC选择培养基上推成平板，在30℃，RH＝60％条件下培养24-48h；④统计各培养基上形成的红色菌落，得出假单孢杆菌在各番茄试材植株内群体的大小及其分布情况，其中0-2茎段所含的假单孢杆菌数量即代表植株的假单孢杆菌的群体大小，0-2，2-4，4-6，6-8，8-10茎段分别所含的假单孢杆菌数量构成的变化曲线构成假单孢杆菌在植株内的分布，汇总后进行参试材料的抗性评价；(3)病圃抗性鉴定①将历年青枯病发病病圃作为青枯病鉴定病圃；
②将步骤(2)获得的抗病材料的种子，培育成生长一致的番茄苗，至7-8叶时定植于病圃内；③定植后1周开始调查，每10天调查一次，共延续3个月，并统计植株萎蔫率，进行番茄生长结果期的抗性鉴定；(4)根据番茄各试材(1)苗期接种鉴定和(2)植株内假单孢杆菌群体大小及其分布检测与(3)病圃抗性鉴定的结果，进行综合评价，划定抗性水平。
通过上述番茄苗期接种鉴定、假单孢杆菌在植株内群体及其分布的检测和病圃抗性鉴定这三个阶段对9个不同抗性材料进行抗性评价。苗期接种鉴定和田间抗性鉴定从植株对病菌的(外在)表现来评价品系之间的抗性差异；植株内假单孢杆菌群体及分布的检测体现了病菌在植株(内在抗性)体内扩繁及延伸能力，亦即不同材料对相同病菌的不同抑制能力，从病菌的角度来评价品系之间的抗性差异。
通过苗期接种鉴定对9个抗性材料进行初步鉴定，认为203在9个抗性材料中抗性水平最低，85198次之，其它7个材料抗性水平相同，均属于高抗材料，植株萎蔫率为0(表1)。
但通过0-2茎段假单孢杆菌菌落数检测(表1)，认为203和85198抗性水平和苗期接种鉴定结果一致，而51198等7个材料存在一定抗性差异；进一步对假单孢杆菌在番茄植株内群体分布进行检测，从其结果来看(图1)，可认为在这9个抗性材料中85254，51255，47254和75854个品系的抗性最强，51198次之，519230和1466EA的抗性水平属于第三层次，而抗性水平最差的是203和85198。
在上述两阶段鉴定的结果上，对这9个抗性材料进行病圃抗性鉴定，验证这9个抗性材料成株对青枯病的耐受能力。鉴定结果(表1)表明85254、51255、47254和7585对青枯病抗性最强，519230和1466EA较强，51198较次，而203和85198依然是抗病能力最差。
经过几种鉴定方法的综合鉴定，可以准确地对这9个抗性材料进行抗性评价，认为在这9个品系中，存在如下的抗性梯度(高抗-感病)(51255，47254)-(85254，7585)-(519230，1466EA)-(51198)-(203，85198)。
表1番茄不同品系苗期接种、假单孢杆菌在植株0-2茎段群体大小检测、病圃鉴定结果比较

注表中字母表示Duncan’s多重比较结果，同一列之间有不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。同一列之间有不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
权利要求
1.番茄青枯病抗性鉴定方法，其特征按以下步骤进行(1)番茄苗期接种鉴定①培育生长基本一致的番茄苗，至5-6叶时备用；②以LB培养基接种假单孢杆菌(Ralstonia solanacearumE.F.Smith)进行扩繁培养；将扩繁后的假单孢杆菌用无菌水稀释至浓度为107cfu/ml的细菌悬浮液；③番茄苗伤根接种，每株接菌种悬浮液30ml；④接种苗在气温25-30℃，土壤相对湿度60％以上条件下培育管理；⑤接种后7天开始调查统计植株萎蔫率，进行番茄苗期抗性鉴定；(2)番茄植株内假单孢杆菌群体及其分布检测①苗期接种抗性鉴定结束后，将未萎蔫植株经冲洗、拭干、75％酒精消毒后，把茎段截取成0-2、2-4、4-6、6-8、8-10cm长度；②分别将各茎段置于10ml无菌水中，在30℃条件下培养，2h后获得细菌悬浮液；③将各茎段细菌悬浮液稀释至该假单孢杆菌的典型菌落在培养基上能清晰明显，易于统计为标准，从中取0.1ml稀释液于TZC选择培养基上推成平板，在30℃，RH＝60％条件下培养24-48h；④统计各培养基上形成的红色菌落，得出假单孢杆菌在各番茄试材植株内群体的大小及其分布情况，进行参试材料抗性评价；(3)病圃抗性鉴定①将历年青枯病发病病圃作为青枯病鉴定病圃；②将步骤(2)获得的抗病材料的种子，培育成生长一致的番茄苗后定植于病圃内；③调查统计植株萎蔫率，进行番茄生长结果期的抗性鉴定；(4)根据番茄各试材(1)苗期接种鉴定和(2)植株内假单孢杆菌群体大小及其分布检测与(3)病圃鉴定的结果，进行综合评价，划定抗性水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的TZC选择培养基中TZC的浓度为50mg/L，余量为LB培养基。
全文摘要
本发明番茄青枯病抗性鉴定方法，属于蔬菜抗病性鉴定技术领域。该方法由番茄苗期接种鉴定、植株内假单孢杆菌群体大小及其分布的检测及成株病圃抗性鉴定三个阶段组成；该方法在传统的基础上，增加了植株内假单孢杆菌群体大小及其分布的检测，使番茄苗期或成株期对青枯病菌外在表现的耐受能力与植株内在感染病菌的程度及其抑制假单孢杆菌在体内扩繁延伸的能力有机地结合起来，进行综合评价，划定抗性水平，从而显著提高了对参试材料抗番茄青枯病的准确水平。
文档编号G01N21/78GK1790018SQ20051006201
公开日2006年6月21日申请日期2005年12月15日优先权日2005年12月15日
发明者杨悦俭, 王荣青, 阮美颖, 叶青静申请人:浙江省农业科学院