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松萝酸通过ROS依赖途径和PI3K/AKT/NRF2信号通路途径诱导Y79细胞凋亡机制的研究

来源：花匠小妙招时间：2025-02-02 22:06

目的:本课题选择人视网膜母细胞瘤Y79细胞为实验对象,以氧化应激及PI3K/AKT/Nrf2信号通路为切入点,对松萝酸诱导Y79细胞凋亡的作用机制展开研究,以期为视网膜母细胞瘤的治疗奠定实验基础,为松萝酸开发利用及临床运用提供科学依据。方法:1.采用CCK-8法检测松萝酸、卡铂及LY294002对Y79细胞增殖的影响,并参考48h的IC50值进行后续实验。再使用流式细胞术检测松萝酸、卡铂和LY294002对Y79细胞凋亡的影响。2.用流式细胞仪检测DCFH-DA荧光探针处理的Y9细胞,分析松萝酸对Y79细胞内ROS水平的影响。采用Mito SOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator进行细胞染色,然后在荧光显微镜上进行拍照、分析,检测松萝酸对Y79细胞线粒体内ROS水平的影响。采用Mito-Tracker Red CMXRos进行细胞染色,然后在荧光显微镜上进行拍照、分析,检测松萝酸对Y79细胞线粒体膜电位的影响。然后再使用流式细胞仪检测抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对Y79细胞凋亡的影响。3.在凋亡信号通路的研究中,采用实时荧光定量PCR、Western blot实验检测松萝酸对Y79细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的m RNA和蛋白表达的影响。在PI3K/AKT/Nrf2信号通路的研究中,采用Western blot实验检测松萝酸对Y79细胞中PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT(Thr308)、p-AKT(ser473)、Nrf2、NQO1、HO-1、SOD1蛋白表达的影响。然后使用流式细胞术检测PI3K抑制剂LY294002和Nrf2抑制剂ML385对Y79细胞凋亡的影响。结果:1.CCK-8测试结果表明,松萝酸呈剂量依赖性抑制Y79细胞活力。形态学观察发现,随着药物剂量的增加,Y79细胞逐渐去聚集化,单细胞增多,细胞数逐渐减少,细胞皱缩、碎片逐渐增多,且失去悬浮性沉底的细胞数逐渐增多。Anne xin V-FITC/PI染色结果显示,松萝酸能使Y79细胞凋亡率上升且与卡铂阳性对照组变化趋势一致。2.DCFH-DA荧光染色结果显示,松萝酸呈剂量依赖性使Y79细胞中ROS水平升高。在Y79细胞线粒体内ROS检测中结果显示,松萝酸剂量依赖性地增加了Y79细胞线粒体内ROS水平,反映为红色荧光的逐渐增强。在Y79细胞线粒体膜电位变化检测中结果显示,松萝酸剂量依赖性地增加了Y79细胞线粒体膜电位损伤,反映为红色荧光的逐渐减弱。在Y79细胞抗氧化检测实验中,抗氧化剂NAC显著降低了松萝酸对Y79细胞的毒性作用,提示细胞内ROS产生的增加在松萝酸诱导的细胞凋亡中起着重要作用。然而,NAC的处理并不能完全逆转松萝酸对Y79细胞的毒性作用,这表明松萝酸诱导的Y79细胞存在额外的ROS非依赖性的细胞凋亡途径。3.在凋亡通路的检测中结果显示,促凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的m RNA和蛋白表达量明显升高,而凋亡抑制基因Bcl-2的m RNA和蛋白表达量被明显抑制,其中Bax/Bcl-2值表达升高。表明松萝酸可以通过激活内源性和外源性两种细胞凋亡途径,导致Y79细胞的程序性死亡。4.在PI3K/AKT信号通路的检测中,CCK-8实验测出的PI3K抑制剂LY29400248h IC50值为35.49μM,选择35μM的浓度用于后续分组。结果显示,各实验组中PI3K、AKT1总蛋白的表达量与Control组均无明显差异。而该信号通路中磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT(Thr308)和p-AKT(Ser473)的蛋白表达均受到明显抑制。组间对比发现,松萝酸联合LY294002用药组中的磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT(Thr308)和p-AKT(Ser473)蛋白表达量均低于单独用药组。说明松萝酸在翻译水平可以有效阻断PI3K/AKT通路中PI3K和AKT1的磷酸化反应,抑制该通路的信号传递。LY294002流式细胞凋亡检测结果显示,在Y79细胞中抑制PI3K通路能诱导细胞凋亡,且LY294002与松萝酸具有协同促Y79细胞凋亡作用。5.在Nrf2信号通路的检测中,松萝酸组中Nrf2、NQO1、HO-1和SOD1的蛋白表达显著升高。LY294002组中Nrf2、NQO1、HO-1和SOD1的蛋白表达显著降低。松萝酸联合LY294002用药组中Nrf2、NQO1、HO-1和SOD1的蛋白表达均低于松萝酸单独用药组,且均高于LY294002单独用药组。表明PI3K抑制剂LY294002能显著抑制Nrf2通路的表达,且联合用药可以部分逆转松萝酸对Nrf2通路的激活作用。提示,在Y79细胞中Nrf2通路受上游PI3K通路的同向调控。然而,松萝酸在Y79细胞中对Nrf2通路的总体影响为激活Nrf2及其下游基因的蛋白表达。ML385流式细胞凋亡检测结果显示,在Y79细胞中抑制Nrf2通路可诱导细胞凋亡,且松萝酸与ML385具有协同作用。结论:1.松萝酸通过介导Y79细胞胞浆中和线粒体内ROS的积累,使细胞产生氧化应激并损伤线粒体,从而诱导Y79细胞凋亡。2.松萝酸通过抑制Y79细胞PI3K/AKT/Nrf2信号通路,并调控内源性和外源性凋亡途径,诱导Y79细胞凋亡。3.抑制Nrf2通路的表达,可以提高Y79细胞对松萝酸的药物敏感性。