一种从芒果叶中提取芒果苷的方法与流程

本发明涉及生物技术领域的提取方法，具体说是一种从芒果叶中提取芒果苷的方法。

背景技术：

芒果(mangiferaindicalinn)是生长于热带和亚热带的果树，广泛分布在我国的海南、广西、广东等省区；广西壮族自治区是芒果的主产地之一，也是广西重点发展的果树，百色地区田东县、田阳县曾经被国家农业部命名为“芒果之乡”。

芒果叶是漆树科植物芒果mangiferaindical的叶子，为广西地方习用中药，收载于《广西中药材标准》1990年版，所含芒果苷(mangiferin)是芒果叶止咳、化痰、抗炎的主要活性成分，芒果苷具有抗炎、抗病毒、中枢神经抑制和免疫抑制作用，还有抗脂质过氧化、抗肿瘤作用，常用以治疗肝炎，芒果苷治疗慢性支气管炎有较好疗效，芒果苷对肝癌细胞株有明显的毒性作用，能诱导肝癌细胞凋亡，芒果苷具有抗氧化活力和延缓衰老作用。我国每年有上千万吨的芒果叶被果农当作柴火烧掉，造成资源的极大浪费。

目前已有对芒果苷的研究，中国专利cn100528170c，公开了将芒果叶用45％以上的乙醇水溶液提取，浓缩后用非极性有机溶剂萃取除去浓缩液中的脂溶性成分，再用90％以上的乙醇水溶液提取得到，从芒果叶中提取的、各种甙类化合物的混合物，含芒果苷单体不少于50％。中国专利cn100475830c“高纯度芒果苷制备方法”、专利cn101759689a“一种芒果苷的制备方法”和专利cn101429222a“提取芒果苷的一种方法”，都是采用大孔树脂纯化作为主要的分离步骤，然而采用大孔树脂纯化方法，树脂用前需要处理，纯化需经过吸附和洗脱过程，生产周期长。在用大孔树脂进行纯化洗脱时，由于物理吸附的原因，也容易造成一部分样品死吸附，而导致转移率降低。另外采用大孔树脂纯化洗脱液体积较大，溶剂回收时间长，增加了生产成本，并且溶剂回收产生较多的废液，对环保造成一定的负担。此外由于大孔树脂的使用，增加了引入苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、烷烃类、二乙基苯类等有机残留溶剂的风险，对产品的安全性造成了一定的影响。

现有研究中，对于从芒果叶中提取芒果苷，一般芒果苷的含量可以做到98.5％以上，但是现有技术得到的芒果苷，其色泽比较深，不利于芒果苷的后续利用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术得到的芒果苷虽然含量高，但是色泽比较深的不足，提供一种从芒果叶中提取芒果苷的方法，得到的芒果苷含量高、色泽浅。

本发明通过以下技术方案实现。

一种从芒果叶中提取芒果苷的方法，具体包括如下步骤：

1)原料处理：将芒果叶粉碎或打碎；

2)高压微射流超微粉碎处理：将上步骤得到的物料，加入等重的纯净水，再加入相当于物料重量0.3-0.5％的石油磺酸钠，用高速剪切乳化机处理10-20min，转速为8000-12000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为80-120mpa，处理次数为2-3次，得到膏状浆液；

3)分离：对得到膏状浆液进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、碳酸钠和水构成，所述聚乙二醇在双水相体系中的质量百分比为15-25％，所述氯化钠在双水相体系中的质量百分比为15-25％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为1000-8000；

4)脱盐处理：将步骤3)获得的萃取上相，脱盐，重结晶，将步骤3)获得的萃取下相，脱盐，重结晶；

5)合并重结晶后的获得物得到芒果苷。

本发明步骤1)所述的芒果叶为新鲜和/或干燥后的芒果叶。

步骤4)所述的脱盐是采用超滤法或透析法，超滤法采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，透析法采用截留分子量为1000-100000的透析袋脱盐。

本发明得到的芒果苷，经hplc检测，含量在99.5％以上，而且色泽比现有技术得到的芒果苷浅。

1、本发明通过使用高压微射流超微粉碎技术处理芒果叶原料，利用高压微射流超微粉碎设备产生挤压力、剪切力、冲击力，经过液-液、液-固之间的高速撞击、高剪切、空穴作用等，使物料的分子结构发生变化。高压微射流超微粉碎设备可以做到纳米分散，细化效果可达0.lum甚至以下，压力高达80-120mpa，得到的溶液颗粒粒径分布均匀，具有操作简单、无污染、可在线清洁消毒、可高效率进行细胞破壁等诸多优点。本发明先采用高压微射流超微粉碎技术处理芒果叶，在采用高压微射流超微粉碎技术处理原料时，加入了石油磺酸钠，其分子结构中有一个强亲水性的磺酸基与烃基相联结，表面活性强，使得芒果叶中的2种性质相反的极性基团：亲水基和亲油基分开吸附，利用非油成分对油和水的亲和力差异及油水比重不同而将油和非油成分分离，利于下步骤的双水相萃取，降低色泽，提高含量。

2、芒果苷水溶性差，易溶于稀醇、热的甲醇和乙醇，易溶于稀碱液；通常伴有其量5％的芒果苷7-o-葡萄糖苷(mangiferin-7-0-r-d-glucopy-ranoside)共存于叶中。因结构中的3位羟基酸性较强，故两化合物均易溶于碱性水液中，芒果苷7-0-葡萄糖苷也可在碱性水液中水解成芒果苷，从而可提高芒果苷的得率和纯度。本发明在萃取时加入碳酸钠，可以充分分离芒果苷和芒果苷7-o-葡萄糖苷，再通过后续工艺，使得芒果苷7-o-葡萄糖苷可以转化为芒果苷，提高了含量。

3、本发明采用高压提取和双水相萃取技术的结合，可以极大的提高生产效率，现有技术柱层析所用的树脂为一般为非极性树脂，经过一次吸附只能得到芒果苷含量40-50％的提取物；如果采用极性树脂，经过一次吸附也只能得到芒果苷含量50％左右，要想获得更高含量的芒果苷必须通过2次或更多次柱层析吸附，从而增加了工艺时间和成本。双水相萃取技术作为一种新型的分离技术，具有条件温和、操作简便、易于放大、分离能力强等一系列优点，而采用本发明的技术结合，出现质的提高，可以增加芒果苷的含量和提取效率，相比水提或醇提后柱层析，本发明时间短，芒果苷含量高。本发明避免了无水乙醇、甲醇等大量有机溶剂的使用，更加环保。

4、通过本发明的方法，得到的芒果苷经hplc检测，含量在99.5％以上，色泽浅，色价e260＜70，现有技术得到芒果苷一般是色价e260＞100。

具体实施方式

下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：

一种从芒果叶中提取芒果苷的方法，具体包括如下步骤：

1)原料处理：将干燥芒果叶粉碎；

2)高压微射流超微粉碎处理：将上步骤得到的物料，加入等重的纯净水，再加入相当于物料重量0.3％的石油磺酸钠，用高速剪切乳化机处理10min，转速为8000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为80mpa，处理次数为2次，得到膏状浆液；

3)分离：对得到膏状浆液进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、碳酸钠和水构成，所述聚乙二醇在双水相体系中的质量百分比为15％，所述氯化钠在双水相体系中的质量百分比为20％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为1000-8000；

4)脱盐处理：将步骤3)获得的萃取上相，采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，重结晶，将步骤3)获得的萃取下相，采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，重结晶；

5)合并重结晶后的获得物得到芒果苷。

实施例2：

一种从芒果叶中提取芒果苷的方法，具体包括如下步骤：

1)原料处理：将新鲜芒果叶打碎；

2)高压微射流超微粉碎处理：将上步骤得到的物料，加入等重的纯净水，再加入相当于物料重量0.4％的石油磺酸钠，用高速剪切乳化机处理20min，转速为12000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为120mpa，处理次数为3次，得到膏状浆液；

3)分离：对得到膏状浆液进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、碳酸钠和水构成，所述聚乙二醇在双水相体系中的质量百分比为25％，所述氯化钠在双水相体系中的质量百分比为20％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为1000-8000；

4)脱盐处理：将步骤3)获得的萃取上相，采用截留分子量为1000-100000的透析袋脱盐，重结晶，将步骤3)获得的萃取下相，采用截留分子量为1000-100000的透析袋脱盐，重结晶；

5)合并重结晶后的获得物得到芒果苷。

实施例3：

一种从芒果叶中提取芒果苷的方法，具体包括如下步骤：

1)原料处理：将新鲜芒果叶打碎；

2)高压微射流超微粉碎处理：将上步骤得到的物料，加入等重的纯净水，再加入相当于物料重量0.5％的石油磺酸钠，用高速剪切乳化机处理15min，转速为10000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为100mpa，处理次数为3次，得到膏状浆液；

3)分离：对得到膏状浆液进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、碳酸钠和水构成，所述聚乙二醇在双水相体系中的质量百分比为20％，所述氯化钠在双水相体系中的质量百分比为25％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为1000-8000；

4)脱盐处理：将步骤3)获得的萃取上相，采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，重结晶，将步骤3)获得的萃取下相，采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，重结晶；

5)合并重结晶后的获得物得到芒果苷。

对比例1：

1)原料处理：将新鲜芒果叶打碎；

2)高压微射流超微粉碎处理：将上步骤得到的物料，加入等重的纯净水，用高速剪切乳化机处理15min，转速为10000r/min，然后用高压微射流超微粉碎设备于25℃进行处理，处理压力为100mpa，处理次数为3次，得到膏状浆液；

3)分离：对得到膏状浆液进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、碳酸钠和水构成，所述聚乙二醇在双水相体系中的质量百分比为20％，所述氯化钠在双水相体系中的质量百分比为25％，余量为水，所述聚乙二醇的重均分子量为1000-8000；

4)脱盐处理：将步骤3)获得的萃取上相，采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，重结晶，将步骤3)获得的萃取下相，采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐，重结晶；

5)合并重结晶后的获得物得到芒果苷。

对比例2：

芒果叶粗粉-70％乙醇浸泡3次-合并浸泡液-减压回收酒精至无酒精味-用活性碳脱色，过滤，放置过夜-上清液上柱-用水洗柱1次，用60％乙醇洗脱-洗脱液浓缩得-乙酸乙酯萃取-浓缩，重结晶得淡黄色膏状物。

对比例3：

1)原料处理：将干燥芒果叶粉碎；

2)高压提取：将处理后的原料，放入高压罐中，加入相同重量的纯净水，加压至4kgf/cm2，使其压力均匀，并保持12min，恢复常压，过滤，得到提取液；

3)分离：对步骤2)物料进行双水相萃取，获得萃取上相和萃取下相，双水相萃取所使用的双水相体系由聚乙二醇、氢氧化钠和水构成，聚乙二醇在所述双水相体系中的质量百分比为15％，氢氧化钠在所述双水相体系中的质量百分比为15％，余量为水，聚乙二醇的重均分子量为1000-8000；

4)后续处理：将步骤3)获得的萃取上相，超滤法采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐、重结晶，将步骤3)获得的萃取下相，加入相当于萃取下相质量百分比10％氢氧化钠，超滤法采用截留分子量为1000-100000的超滤膜脱盐、重结晶；

5)合并干燥后的获得物得到芒果苷。

实验例1：芒果苷色价的测定

1、试剂

1.1水或者其它有机试剂，如甲醇，乙醇或其与水的混合溶液。

2、样品

2.1实施例和对比例得到的样品。

3、仪器和用具

3.1分析电子天平。

3.210ml容量瓶。

3.3超声波清洗器。

3.4分光光度计以及1cm比色皿

4.主要操作步骤：准确称取0.1000g试样，精确至0.0002g，溶于ph为8.0的磷酸盐缓冲溶液中，40℃水浴1h使黑色素溶解后定容至100ml容量瓶中，以吸光度在0.2-0.6时为宜，如超出，则再精确吸取一定量的稀溶液稀释。在芒果苷最大吸光度260nm处，用磷酸盐缓冲液作参比液，测其吸光度。

按下列公式计算黑色素溶液的色价：e＝axf/m(式中：a为实测吸光值；f为稀释倍数；m为试样质量)

结论：

1、实施例得到的芒果苷色价稳定在62-65，而对比例的色价在88-125。

2、对比例1的方法没有采用实施例所使用的“高压微射流超微粉碎技术处理原料时，加入了石油磺酸钠”技术，对比例1的色价较实施例还是偏高。

3、对比例2采用醇提-柱层析-乙酸乙酯萃取的技术方案，色价最高。

4、对比例3采用了高压提取-双水相萃取的技术方案，在提取时没有加入石油磺酸钠，对比例3的色价较实施例还是偏高。

实验例2：芒果叶提取物中芒果苷(mangiferin)含量测定

色谱条件

色谱柱：supelcolc-18-db15cmx4.6mm5μm

流动相：10％乙腈：磷酸(100：0.2，v/v，用三乙胺调ph3-4)

流速：lml/min

检测波长：260nm

柱温：室温

进样量：5μl或10μl

结果：

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