两种凤尾蕨属植物有效成分提取纯化、结构鉴定及其生物活性研究

两种凤尾蕨属植物有效成分提取纯化、结构鉴定及其生物活性研究

【摘要】： 中草药是治疗各种重大疾病的先导物的主要来源,为人类的健康作出了巨大贡献。凤尾蕨属(Pteris)植物作为重要的中草药资源,具有较高的开发价值。我国约有66种凤尾蕨属植物,其中近30种可作为传统药物,大多具有清热解毒、利湿通淋、消肿止痛、止血和止痢等功效。现代研究表明,凤尾蕨属植物中含有黄酮类和萜类等成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌/病毒和抗糖尿病等作用,对其开发利用已成为研究热点。黄酮类化合物作为凤尾蕨属植物的主要活性成分,近年来,对其研究应用日趋重视,由于其提取率与纯度对生物活性具有重要影响,因此亟需建立一种可获得高产率、高纯度的黄酮类成分的提取纯化工艺。此外,目前对该属的凤尾草、蜈蚣草、半边旗和欧洲凤尾蕨等药用植物的化学成分及生物活性研究较多,而对其他药用植物研究相对匮乏,导致这些药用植物的有效成分不明、有效性受到质疑,使其开发利用受到限制。鉴于此,为了促进我国丰富的凤尾蕨属药用植物资源的科学开发利用,本论文选取两种极具开发潜力但研究较少的凤尾蕨属药用植物——剑叶凤尾蕨(Pteris ensiformis Burm.)和阔叶凤尾蕨(Pteris esquirolii Christ)为实验材料,主要研究方法与结果如下:1)剑叶凤尾蕨总黄酮(Pe B–TP)的提取与纯化工艺优化。首先,采用单因素实验结合正交实验对加热回流法提取Pe B–TP的工艺参数(提取溶剂、提取时间、提取温度和液料比)进行了优化,在最佳条件下(70%乙醇、120 min、70℃和20 m L/g),Pe B–TP得率为35.73±0.52 mg/g;采用单因素实验结合响应面实验对超声波辅助提取Pe B–TP的工艺参数(提取溶剂、超声时间、超声温度和液料比)进行了优化,在最佳条件下(67%乙醇、38 min、66℃和20 m L/g),Pe B–TP得率为32.47±0.40 mg/g。可以看出,加热回流法提取Pe B–TP的得率高于超声波辅助提取法。然后,通过考察10种树脂对Pe B-TP的吸附/解吸性能,筛选出NKA-II树脂为最佳树脂。吸附动力学、等温线、热力学研究表明Pe B–TP在NKA-II树脂上的吸附最符合准二级动力学模型和Langmuir模型,且为自发的、放热的、熵减的物理吸附过程。通过动态吸附/解吸实验确定NKA-II树脂柱(1BV=19.5 m L)纯化Pe B–TP的最佳工艺为Pe B–TP浓度1.84 mg/m L、上样流速2 BV/h、上样量5 BV、洗脱剂50%乙醇、洗脱流速2 BV/h、洗脱剂用量7 BV。经过一步放大规模(1 BV=720 m L)的纯化,Pe B–TP纯度提高至纯化前的3.16倍,回收率为80.25%。2)剑叶凤尾蕨不同极性部位活性评价及有效成分分离鉴定。对剑叶凤尾蕨95%乙醇粗提物及其五个不同极性部位的生物活性评价结果表明,总体上,乙酸乙酯极性部位(Pe B–Et OAc)表现出较好的抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶、抗炎和抗肿瘤活性。接下来,结合各种色谱、波谱技术对活性部位Pe B–Et OAc的有效成分进行了研究,结果分离鉴定了21个化合物。共17个化合物首次从该植物中分离得到,包括8个黄酮类化合物(槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-新橘皮糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、羟基芫花素和3',5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮和芹菜素),3个倍半萜类化合物((2S,3S)-wallichoside、(3R)-pterosin D和(2R,3R)-pterosin L),3个含氮化合物(L-焦谷氨酸、烟酰胺和L-苯丙氨酸),1个酚酸类化合物(异阿魏酸),1个呋喃类化合物(5-羟甲基糠醛)和1个香豆素类化合物(7-羟基香豆素),其中8个化合物(槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、羟基芫花素、3',5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮、L-焦谷氨酸、烟酰胺、L-苯丙氨酸、异阿魏酸和5-羟甲基糠醛)首次从该属中分离得到。3)阔叶凤尾蕨乙酸乙酯极性部位(Pe C–Et OAc)有效成分分离鉴定。通过各种色谱、波谱技术从阔叶凤尾蕨中首次分离并鉴定19个化合物,包括6个倍半萜类化合物((±)-14-hydroxypterosin B、(2S,3S)-wallichoside、(2S,3S)-pterosin S、(2S,3S)-pterosin C、(2R,3S)-pterosin C和dehydropterosin B),9个黄酮类化合物(槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、染料木苷、山奈酚、木犀草素、柚皮素和羟基芫花素),1个苯丙醇苷类化合物(紫丁香苷)和3个酚酸类化合物(绿原酸、香草酸和对羟基苯甲酸)。其中,(±)-14-hydroxypterosin B为新化合物,8个化合物(槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、染料木苷、柚皮素、羟基芫花素、紫丁香苷和香草酸)首次从该属中分离得到。4)蕨素和黄酮类化合物抑制α-葡萄糖苷酶及抗肿瘤作用研究。基于分子对接技术对蕨素类化合物抑制α-葡萄糖苷酶活性评价,结果筛选出(2S,3S)-wallichoside与α-葡萄糖苷酶(PDB ID:3A4A)结合能力最强,验证结果表明(2S,3S)-wallichoside抑制α-葡萄糖苷酶的EC_(50)为0.33 mmol/L。CCK-8法评价部分黄酮类化合物和蕨素的抗肿瘤作用结果表明,羟基芫花素对人结肠癌HCT-116细胞具有较强的抑制作用(IC_(50)=5.88μmol/L),进一步研究表明,羟基芫花素能够降低HCT-116细胞克隆形成率、提高胞内ROS水平,能够通过下调cyclin-D1和CDK-4蛋白的表达将细胞周期阻滞于G0/G1期,通过上调Bax和cleaved caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2蛋白表达促进细胞凋亡。综上,通过本研究建立的提取纯化工艺可获得高产率、高纯度的Pe B–TP,具有较好的工业化应用前景。同时,本研究有助于明确剑叶凤尾蕨和阔叶凤尾蕨的药效物质基础,为天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂和抗结肠癌药物的研发奠定了一定的基础,为这两种凤尾蕨属药用植物资源的合理开发提供了科学参考。

【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2021

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