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蜡梅花提取物作为环氧酶

来源：花匠小妙招时间：2025-01-15 07:35

蜡梅花提取物作为环氧酶-2抑制剂的新用途

1.本发明属于医药技术领域和保健食品领域，具体涉及蜡梅花提取物作为环氧酶-2 (cox-2)抑制剂的新用途。

背景技术：

2.环氧酶又称前列腺素内过氧化物合酶(ptgs)，是前列腺素合成初始步骤中的关键限速酶。近年来的研究表明，cox存在两种亚型即cox-1、cox-2。cox-1被认为是管家基因，它在许多细胞及组织中稳定表达，其产物主要功能为维持胃肠道粘膜的完整性，血液稳定以及正常肾功能等。cox-2的表达受到多种途径的严格调控，在生理状态下它只在少数组织表达，但在多种急慢性炎症，类风湿性关节炎，骨关节炎，alzheimer症以及肿瘤等病理过程中， cox-2在局部组织和细胞中大量诱导表达，引起炎症部位的前列腺素e2、前列腺素i2等的含量增加，促进了炎症反应和组织损伤，在疾病发生、发展及预后恢复等过程中起重要的作用。
3.蜡梅(chimonanthus praecox(l.)link)为蜡梅科(calycanthaceae)蜡梅属 (chimonanthus spp.)植物，是特产我国且栽培历史悠久的名贵花木，在我国栽培广泛。蜡梅花有很高的药用价值和保健价值。李时珍在《本草纲目》中记载：“蜡梅花，辛，温，无毒，主治解暑生津”。中医用于治疗暑热头晕，呕吐，气郁胃闷，麻疹，百日咳。外用浸于花生油或菜油中成“蜡梅花油”，治烫火伤、中耳炎。而其食用价值早在《救荒本草》中就有记载：“采花焯熟，水浸淘净，油盐调食”。在古代，有用蜡梅作菜着或点心的历史，用蜡梅花与其他食物搭配可制作蜡梅豆腐汤、蜡梅玻璃鸡片等，既是味道颇佳的食品，又能“解热生津”。此外，蜡梅花还可直接做茶饮，将蜡梅花风干后加入茶叶，制成蜡梅花茶，或直接用花数朵，冲入开水代茶，香气浓郁，有生津、止咳、顺气、解毒等功效，品质别具一格。
4.现代药理学研究表明，蜡梅中黄酮、生物碱、挥发油类成分，具有抗菌抗病毒作用，蜡梅花精油对弗氏完全佐剂致大鼠足趾肿胀有明显的抑制作用，其抗炎作用的发挥可能与抑制 tnf-α和il-1β有关。但目前暂未发现公开蜡梅花作为环氧酶-2抑制剂的现有技术。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供蜡梅花提取物作为环氧酶-2抑制剂的新用途。蜡梅花提取物作为环氧酶-2抑制剂用于医药、化妆品及保健食品领域。
6.本发明所述含有蜡梅花提取物的药品、化妆品或保健食品选自片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、口含剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、气雾剂、贴剂、糊剂、混悬剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、酊剂、口服液、水剂、乳剂、油剂、凝胶剂。
7.本发明所述环氧酶-2抑制剂可用于骨关节炎、类风湿性关节炎、肌肉骨骼损伤、脊椎关节炎、银屑病关节炎、腱鞘炎、滑囊炎、炎症性皮肤病、痛经、急性疼痛、偏头痛、胃肠癌、肝癌、皮肤癌、阿尔兹海默症。
附图说明
8.图1为本发明中蜡梅花提取物抑制lps刺激的小鼠巨噬细胞株raw264.7上清中pge2含量的分析图。其中，
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p＜0.01vs.正常对照组(无lps组)；
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p＜0.05，
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p＜0.01vs.模型组 (lps-treated alone group)。
9.图2为本发明中蜡梅花提取物抑制lps致内毒素血症小鼠血清中pge2含量的分析图。其中，
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p＜0.01vs.正常对照组；
**
p＜0.01vs.模型组(lps-treated alone group)。
10.图3为本发明中蜡梅花提取物抑制lps刺激的小鼠巨噬细胞株raw264.7中cox-2酶活性的作用分析图。其中，
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p＜0.05，
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p＜0.01vs.空白对照组。
11.图4为本发明中蜡梅花提取物抑制小鼠脑组织cox-2酶活性的作用分析图。其中，
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p＜0.05，
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p＜0.01vs.空白对照组。
具体实施方式
12.实施例1 蜡梅花提取物的制备。
13.(1)实验材料：
14.蜡梅花(拉丁名：chimonanthus praecox(l)link；产地，北京)，乙醇(北京化工厂有限责任公司)
15.(2)实验方法：
16.采摘蜡梅科植物蜡梅(拉丁名：chimonanthus praecox(l)link)的花(2月份花初开时)，阴干，取干燥花100g，用85％的乙醇浸泡过夜后，回流提取2次，料液比1∶20，每次2h，合并两次的提取液，经旋转蒸发仪浓缩后，于60℃恒温水浴上干燥至恒重，得到棕色固体，即为蜡梅花提取物。
17.(3)实验结果：
18.蜡梅花提取物得率为33.67％，其中芦丁和槲皮素的含量分别为4.2％和0.13％。
19.实施例2 蜡梅花提取物对lps刺激的raw264.7细胞分泌pge2的作用。
20.(1)实验材料：
21.蜡梅花提取物，dmem培养基(美国gbico公司，cat no.12100-046)，lps(美国 sigma-aldrich公司，cat no.l4130)，塞来昔布(北京索莱宝科技有限公司，cat no.c9180)， pge2高灵敏elisa检测试剂盒(美国enzo生命科学公司，cat no.adi-930-001)，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株raw264.7来源于美国模式培养物集存库(atcc)，货号：tib71。
22.(2)实验方法：
23.取处于对数生长期的raw264.7细胞，按4
×
104个/孔均匀接种于96孔板中，各给药组分别给予终浓度为25，50或100μg/ml的蜡梅花提取物或100nm的塞来昔布(阳性药组)，同时给予终浓度为8ng/ml的lps，正常对照组给予等体积培养基替代lps和蜡梅花提取物， lps模型组则只含等浓度lps而不含蜡梅花提取物。培养24h后，取出每孔培养上清液，按照enzo pge2高灵敏elisa检测试剂盒说明书方案，检测上清中pge2的含量。
24.(3)实验结果：
25.如图1所示，与正常对照组相比，在lps的刺激下，rwa264.7巨噬细胞产生的pge2明显增加，阳性药塞来昔布可以大幅抑制lps诱导的pge2的生成，而蜡梅花提取物在不影响细
胞增殖活性的情况下，能够剂量依赖地抑制lps诱导的raw264.7细胞上清中pge2的水平。
26.实施例3 蜡梅花提取物对lps致内毒素血症小鼠血清pge2的作用。
27.(1)实验材料：
28.蜡梅花提取物，lps(美国sigma-aldrich公司，cat no.l4130)，塞来昔布(北京索莱宝科技有限公司，cat no.c9180)，生理盐水(石家庄四药有限公司)，pge2高灵敏elisa检测试剂盒(美国enzo生命科学公司，cat no.adi-930-001)。
29.实验动物来源及伦理许可：icr小鼠，雄性，6-8周龄，体重18-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(实验动物许可证编号：syxk(beijing)2017-0020)。此实验在中国医学科学院药用植物研究所动物伦理委员会的批准和监督下进行(伦理许可编号： slxd-2017060713)。
30.(2)实验方法：
31.体重18-22g的雄性icr小鼠随机分为六组，每组8只，在spf级实验动物房作适应性饲养，实验前12h禁食不禁水。给小、中、大剂量蜡梅花提取物组预先腹腔注射溶解于生理盐水的蜡梅花提取物，小剂量组125mg/kg，中剂量组250mg/kg，大剂量组500mg/kg。给药塞来昔布组同样预先腹腔注射，剂量为30mg/kg，正常对照组和模型组以等体积的生理盐水代替，各组给药体积均为500μl/只。30min后，模型组与给药组尾静脉注射lps(300μl/ 只，溶解于生理盐水)，剂量1mg/kg，正常对照组注射等体积生理盐水代替。注射lps 2h 后，以异氟烷吸入将小鼠麻醉，眼眶采血并收集于1.5ml ep管内。采血后的小鼠立即脱颈处死。采集的小鼠全血置于4℃下静置过夜使血清充分析出，3000g离心10min收集血清，用于pge2水平的测定。
32.(3)实验结果：
33.如图2所示，小鼠尾静脉注射lps后2h，血清中炎症因子pge2含量明显升高，而给予阳性药塞来昔布组，血清中pge2含量较模型组大幅下降，同时，给予蜡梅花提取物组，血清中pge2含量亦显著降低，并呈现出剂量依赖关系，随着蜡梅花提取物浓度越高，抑制内毒素血症小鼠血清中pge2作用越显著。
34.实施例4 蜡梅花提取物对小鼠脑组织cox酶活的影响。
35.(1)实验材料：
36.蜡梅花提取物，塞来昔布(北京索莱宝科技有限公司，cat no.c9180)，花生四烯酸(上海源叶科技有限公司，cat no.b20540)，还原型谷胱甘肽(北京索莱宝科技有限公司，cat no. g8180，l-肾上腺素(上海吉至生化科技有限公司，cat no.f-l04911)，tris盐酸(上海吉至生化科技有限公司，cat no.t70220)，pge2高灵敏elisa检测试剂盒(美国enzo生命科学公司，cat no.adi-930-001)。
37.实验动物来源及伦理许可：icr小鼠，雄性，6-8周龄，体重18-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(实验动物许可证编号：syxk(beijing)2017-0020)。此实验在中国医学科学院药用植物研究所动物伦理委员会的批准和监督下进行(伦理许可编号： slxd-2017060713)。
38.(2)实验方法：
39.a)小鼠脑匀浆的制备：取内毒素血症小鼠脑组织，称重，加入3倍体积预冷的匀浆缓冲液 (50mm tris-hcl，ph 7.4)，置于冰上匀浆1min。匀浆液在4℃下，1000g离心10min。
离心后的上清用匀浆缓冲液稀释10-40倍备用。
40.b)匀浆上清中cox酶活的测定：反应管中每管分别加入340μl tris-hcl(ph 7.4)，50μl 50 mm还原性谷胱甘肽，50μl 50mm肾上腺素。每管再加入50μl稀释到合适浓度的匀浆上清。在每管中加入10μl 1.5mm花生四烯酸后启动酶反应，用锡纸包裹反应管后，37℃水浴30min。之后，95℃煮沸10min以终止反应。所得反应液在4℃下，3000g离心10min 后，收集上清用于pge2含量的测定。
41.(3)实验结果：
42.结果如图3所示，在小鼠脑匀浆中加入cox酶的底物花生四烯酸后，大量pge2生成。而阳性药塞来昔布可以大幅抑制脑匀浆中cox酶的活性，从而抑制pge2的生成。同样，蜡梅花提取物以浓度依赖方式显著抑制pge2的生成，即抑制脑匀浆中cox酶的活性，并且大剂量时，抑制cox酶活效果与阳性药塞来昔布相当。表明，在体外，蜡梅花提取物也能够表现出非常好的抑制cox酶活性的效果。
43.实施例5 蜡梅花提取物对lps刺激的raw264.7细胞中cox-2酶活性的影响。
44.(1)实验材料：
45.蜡梅花提取物，dmem培养基(美国gbico公司，cat no.12100-046)，lps(美国 sigma-aldrich公司，cat no.l4130)，塞来昔布(北京索莱宝科技有限公司，cat no.c9180)， pge2高灵敏elisa检测试剂盒(美国enzo生命科学公司，cat no.adi-930-001)，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株raw264.7来源于美国模式培养物集存库(atcc)，货号：tib71。
46.(2)实验方法：
47.取处于对数生长期的raw264.7细胞，给予终浓度8ng/ml的lps刺激12h以诱导cox-2 的生成，之后用d-hanks液洗细胞3次后，将细胞按4
×
104个/孔均匀接种于96孔板中，各给药组分别给予终浓度为25，50或100μg/ml的蜡梅花提取物或终浓度100nm的塞来昔布 (阳性药组)，lps模型组则用等体积的培养基代替。继续培养12h后，取出每孔培养上清液，按照enzo pge2高灵敏elisa检测试剂盒说明书方案，检测上清中pge2的含量。
48.(3)实验结果：
49.在此实验中，首先用lps刺激巨噬细胞12h以诱导巨噬细胞中cox-2的生成，之后通过更换培养基撤去lps，由于细胞不会继续被lps刺激，此时细胞中所产生的cox-2的量就不会进一步增加。在这种情况下再用药物处理细胞，药物不会影响细胞中cox-2酶的多少，而只可能通过抑制已经生成cox-2的酶活性，显示出抑制上清pge2含量的作用。实验结果如图4所示，阳性药塞来昔布可以明显抑制cox-2的酶活性，蜡梅花提取物也可以浓度依赖地抑制cox-2的酶活性。