首页分享开花作物授粉后柱头花粉数量的检测方法

开花作物授粉后柱头花粉数量的检测方法

来源：花匠小妙招时间：2025-01-09 00:44

开花作物授粉后柱头花粉数量的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种开花作物花期授粉后柱头花粉数量的检测方法，包括柱头染色、分离并收集花粉、载玻片的制作、扫描载玻片、利用计数软件统计花粉粒数量及显微镜下计数等步骤。本方法具有较高的准确性和适用性，能够较大程度地避免由于人为因素等造成的误差，也可以经适当调整推广至多种开花作物的柱头花粉数量的统计上。
【专利说明】开花作物授粉后柱头花粉数量的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业科学【技术领域】，具体地说，涉及开花作物授粉后柱头花粉数量的检测方法。
【背景技术】
[0002]桃是主要的温带水果之一，在全球范围内广泛栽培，中国桃种植面积和产量均居世界第一位。桃属于时令性鲜果，不耐储藏，而设施栽培技术可以通过改变影响桃树生长的环境因子如光照、温度、水分、CO2、土壤条件等，达到调节果实成熟期的目的，满足消费者对新鲜、无污染、反季桃的需求，同时，可为种植者带来丰厚的利润。
[0003]花期传粉是影响开花作物座果结实的重要因素，桃花属于典型的虫媒花，昆虫传粉可以显著提高桃产量。然而近十多年来，随着农业种植结构的调整，经济作物单一品种大规模种植模式(一县一品或一村一品现象)逐步推广，使得野生传粉昆虫丧失了周年栖息的食物源，往往导致主产区野生传粉昆虫数量急剧下降。桃树花期较短，且主产区野生传粉昆虫较少，容易出现授粉不足现象。由于授粉不足而导致桃产量下降的现象在设施栽培中表现更为明显。设施桃在生长过程中，尤其在花期前后，处于与外界相对隔离的环境中，空气流动性较差且缺乏自然传粉昆虫，因授粉受精不充分而导致的落花落果现象尤为严重。为保障桃花充分授粉，提高产量，种植者在花期常采用人工方式或引入传粉昆虫为桃花授粉。虽然人工授粉可以显著提高座果率，但是需要耗费大量人力物力，与之相比，采用昆虫为桃花授粉，不但可降低生产成本，而且可以提高桃产量，改善果实品质，具有明显优势。
[0004]在桃生产中应用较为广泛的传粉昆虫主要包括蜜蜂、熊蜂和壁蜂等几大类，由于不同传粉昆虫形态结构及生物学习性等方面存在较大差异，导致其为桃树授粉时效率不同，因而对桃树最终产量造成影响；同时，授粉昆虫配置数量也可影响桃树座果情况。因此，在桃树种植生产过程中，根据桃花开花生物学特点及种植环境，选择传粉效率较高的传粉昆虫并配备适当数量的昆虫进行授粉，成为桃树丰产栽培的必备环节。而在桃树花期选择合适指标评价昆虫的传粉效率，并根据指标及时对传粉昆虫的数量等进行调控，无疑可以最大程度地提高桃树产量。
[0005]目前对昆虫传粉效率的研究多集中在访花频率、访花时间，接触柱头频率，携带花粉量等指标上。该类指标虽然可以在一定程度上反映出不同昆虫的访花行为差异，但任一单个指标均无法直接对桃的传粉受精过程造成影响，不能有效地评价昆虫传粉效率。研究表明，植物雌蕊柱头花粉沉降数量与座果率高度相关。在柱头所能承受的花粉数量范围内，花粉沉降数量越多，越有利于受精过程的进行，而成功的受精则是植物座果结实的前提。因此统计昆虫访花后桃花柱头花粉沉降数量，可直接反映出昆虫传粉效率的高低。
[0006]目前检测柱头花粉沉降数量的方法主要包括直接在解剖镜下观察柱头和使用盐酸等溶液将花粉与柱头分离，利用血球计数板统计花粉数量。直接在显微镜下观察柱头并统计花粉粒数量需要鉴定者正确识别柱头上的花粉粒，然而桃花花粉颜色与柱头组织相似，并且花粉粒在柱头萌发后吸附在柱头表面不同位置，造成计数时难以观察并辨别花粉粒，加之桃花柱头上的花粉数量有时高达上千粒以上，导致工作量大，统计困难，不同鉴定者的统计结果往往存在较大误差，无法保障结果的可靠性；利用特定溶液将花粉粒与柱头分离，再使用血球计数板在显微镜下计数，虽然避免了柱头组织对花粉粒辨别的干扰并在一定程度上提高了可靠性，但是仍需要耗费大量时间以肉眼统计花粉粒数量，且对人员操作性要求较高。

【发明内容】

[0007]本发明的目的是提供一种开花作物花期授粉后柱头花粉数量的检测方法，从而有效及快速评价传粉昆虫的传粉效率。
[0008]为了实现本发明目的，本发明的一种开花作物花期授粉后柱头花粉数量的检测方法，包括柱头染色、分离并收集花粉、载玻片的制作、扫描载玻片、利用计数软件统计花粉粒数量及显微镜下计数等步骤。
[0009]上述检测方法包括以下步骤:
[0010]I)柱头染色:采集开花作物花期授粉后的柱头置于离心管中，向离心管中加入孔雀石绿染色液进行染色，收集染色液作为溶液I ;
[0011]2)分离并收集花粉:将柱头转移至另一盛有孔雀石绿染色液的平底试管中，利用超声波细胞破碎仪破碎柱头组织，实现花粉粒与柱头的分离，收集染色液作为溶液II，用
0.85%-1.15% (优选l%)NaCl溶液冲洗细胞破碎仪变幅杆上附着的花粉粒，收集冲洗液作为溶液III ;合并溶液1、II和III，用真空抽滤瓶将上述合并液中的花粉粒收集在滤膜上；
[0012]3)载玻片的制作及扫描:将花粉粒收集在滤膜上后，将滤膜载有花粉粒面朝上，平展贴服于滴有15%-40% (优选30%)甘油溶液的载玻片上，制作成临时装片，用扫描仪将载玻片上的滤膜扫描为电子照片；
[0013]4)采用Image J软件统计滤膜上花粉粒数量，并将步骤2)中残余的柱头组织置于载玻片上，在显微镜下计数残留的花粉粒数量，滤膜上花粉粒数量与柱头残留的花粉粒数量之和，即为开花作物花期授粉后柱头花粉数量。
[0014]在抽滤溶液分离花粉过程中，由于真空泵的使用，集液瓶中的连续负压可形成抽动力，在过滤装置密闭性良好及过滤砂芯无堵塞的情况下，该力均匀地作用于滤膜表面，使得流经滤膜的溶液与滤膜均匀接触，从而确保花粉粒与溶液分离时受力均匀，花粉粒可以充分分散地吸附于滤膜上；同时，在整个分离花粉过程中，由于经过多次溶液抽滤，花粉粒不断地悬浮分散、再吸附于滤膜上，提高了花粉粒的分散性，降低了花粉粒重叠的概率，避免了因花粉粒之间相互重叠可能导致的统计误差。
[0015]前述的检测方法，还包括用0.85%-1.15% (优选l%)NaCl溶液冲洗步骤I)中所述的离心管，以收集附着于管壁上的花粉粒，作为溶液IV，以及用0.85%-1.15%(优选l%)NaCl溶液冲洗步骤2)中所述的平底试管，以收集附着于管壁上的花粉粒，作为溶液V ;将溶液1、
I1、II1、IV和V合并后进行真空抽滤。
[0016]本发明中使用的孔雀石绿染色液是由0.1%孔雀石绿溶液与0.85%-1.15% (优选1%) NaCl溶液按1:400的体积比混合配制而成。
[0017]前述的检测方法，步骤I)中染色时间为15h，染色温度为37°C，以200rpm转速进
行摇床震荡染色。[0018]前述的检测方法，步骤2)中利用超声波细胞破碎仪破碎柱头组织所设定的程序如下:全程超声时间60s，超声时间60s，间歇时间Os，温度保护设定为50°C，超声功率100W，变幅杆规格为Φ6。
[0019]前述的检测方法，步骤3)中收集花粉所用真空抽滤瓶的过滤杯容积为300mL，集液瓶容积为2000mL，主体材质为硼砂玻璃，砂芯过滤基座材质为磨砂玻璃，过滤砂芯直径为20mm ;滤膜材质为尼龙，滤膜孔径为10-30 μ m,滤膜形状为20mm <直径< 25mm的圆形，或20mm <边长< 25mm的正方形；使用时,将合并液倒入过滤杯中，经真空抽滤,花粉粒吸附于滤膜上，残余液体流经滤膜和过滤砂芯，收集于集液瓶中。
[0020]前述的检测方法，当所述开花作物为桃时，步骤4)中采用ImageJ软件统计滤膜上花粉粒数量，目标颗粒色彩参数设定范围为:色彩值120-150，饱和度70-255，亮度0-255，目标颗粒大小设定值为40-80，圆形轮廓设定值为0.5-0.8。且步骤3)中滤膜孔径为20 μ m。
[0021]本发明中涉及的开花作物花期授粉方式为昆虫传粉。
[0022]本发明提供的开花作物花期授粉后柱头花粉数量的检测方法，具有较高的准确性和适用性，能够较大程度地避免由于人为因素等造成的误差，也可以经适当调整推广至多种开花作物的柱头花粉数量的统计上。
[0023](一)本方法在操作过程中能够较大程度地降低或避免系统误差。在收集花粉环节，收集了平底试管中的染色液、离心管中的染色液及冲洗液等中的花粉，有效提高统计结果准确度，降低系统误差。
[0024](二)本发明在花粉计数环节依据花粉本身特性，设定滤膜孔径大小和软件参数，提高了精确性，避免了由于观察者个体间的差异造成的误差。同时也可以选择不同孔径大小的滤膜及适当调整软件参数，将该方法推广至其他作物的柱头花粉数量的统计上，具有较强适用性。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0026]实施例检测桃花柱头花粉沉降数量的方法
[0027]包括以下步骤:
[0028]1、柱头染色:在每只装有样品柱头的1.5mL Eppendolf离心管中加入1.4mL孔雀石绿染色液(0.1%孔雀石绿与l%NaCl溶液按1:400体积比配制而成)，摇床震荡染色15h(37°C，200rpm;较高的温度使花粉粒容易着色，摇床震荡确保染色均匀)，收集染色液作为溶液I。
[0029]2、分离花粉:使用洁净镊子取出柱头，置于装有IOmL孔雀石绿染色液的平底试管中，利用超声波细胞破碎仪(JY92-1I DN，中国)超声处理柱头组织(程序设定如下:全程时间60s，超声时间60s，间歇时间Os，温度保护设定为50°C，超声功率100W，变幅杆规格为Φ6)，使花粉粒脱离柱头，超声结束后取出平底试管，收集染色液作为溶液II ;换另一洁净平底试管置于变幅杆下端，防止变幅杆上残留的染色液滴落而造成花粉粒数量损失，另外，用l%NaCl溶液冲洗变幅杆上附着的花粉粒，收集冲洗液作为溶液III。
[0030]3、收集花粉:经过超声处理，大部分花粉粒脱离柱头并悬浮于染色液中，但仍有少数花粉粒可能吸附在柱头组织上以及盛装器皿中，因此使用l%NaCl溶液冲洗柱头、镊子、离心管及平底试管，收集冲洗液作为溶液IV，合并上述溶液1、I1、III和IV，收集在过滤杯中进行真空过滤，最后使用l%NaCl溶液冲洗过滤杯，再次进行真空过滤，最终将柱头表面花粉粒收集于滤膜上(真空过滤瓶型号为FB-20T，中国天津奥特赛恩斯仪器有限公司生产，其中过滤杯规格300mL，集液瓶规格2000mL，主体材质为硼砂玻璃，砂芯过滤基座材质为磨砂玻璃，砂芯直径为20mm ;过滤膜型号为03-20/3,其材质为尼龙,孔径20 μ m,瑞士赛发公司生产，将滤膜裁剪成20mmX20mm方块，覆盖在过滤砂芯上方，以承载花粉粒；真空抽滤泵型号为2522Z-02，美国WELCH公司生产)。
[0031]将经NaCl溶液冲洗的柱头组织置于载玻片上，在显微镜下检查是否仍有残余花粉粒，若花粉残余量少且在显微镜下可进行准确计数，则直接对残余花粉粒进行计数并记录，若花粉残余量过大，无法进行准确计数，则按照上述方法重新超声处理柱头。
[0032]4、扫描花粉:使用移液器在洁净的载玻片中央滴30μ L30%甘油溶液，使用洁净镊子取出载有花粉粒的滤膜，平贴在载玻片中央，使甘油溶液浸湿滤膜，要求滤膜平整，无气泡。使用可以扫描玻片的扫描仪将载玻片上的滤膜扫描为电子照片(扫描仪型号尼康Coolscan9000ED,日本)。
[0033]5、软件计数:利用Image J软件统计滤膜上花粉粒数量，具体参数设定如下:色调值为120-150，饱和度值为70-255，亮度:0-255，目标颗粒物大小值为40-80，圆形轮廓值为
0.5-0.8,得出滤膜上花粉粒数量,与柱头剩余花粉粒数量相加,得出柱头花粉沉降数量。
[0034]本发明的一种用于桃花柱头花粉沉降数量的检测方法，依据桃花粉粒的形状、大小及花粉粒及柱头组织的不同染色特性进行设计，在较大程度上避免了人为操作误差，提高了检测准确性，也适用于其他开花作物柱头花粉沉降数量的检测。
[0035]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.开花作物花期授粉后柱头花粉数量的检测方法，其特征在于，包括柱头染色、分离并收集花粉、载玻片的制作、扫描载玻片、利用计数软件统计花粉粒数量及显微镜下计数的步骤。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: O柱头染色:采集开花作物花期授粉后的柱头置于离心管中，向离心管中加入孔雀石绿染色液进行染色，收集染色液作为溶液I ; 2)分离并收集花粉:将柱头转移至另一盛有孔雀石绿染色液的平底试管中，利用超声波细胞破碎仪破碎柱头组织，实现花粉粒与柱头的分离，收集染色液作为溶液II，用0.85%-l.15%NaCl溶液冲洗细胞破碎仪变幅杆上附着的花粉粒，收集冲洗液作为溶液III ；合并溶液1、II和III，用真空抽滤瓶将上述合并液中的花粉粒收集在滤膜上； 3)载玻片的制作及扫描:将花粉粒收集在滤膜上后，将滤膜载有花粉粒面朝上，平展贴服于滴有15%-40%甘油溶液的载玻片上，制作成临时装片，用扫描仪将载玻片上的滤膜扫描为电子照片； 4)采用ImageJ软件统计滤膜上花粉粒数量，并将步骤2)中残余的柱头组织置于载玻片上，在显微镜下计数残留的花粉粒数量，滤膜上花粉粒数量与柱头残留的花粉粒数量之和，即为开花作物花期授粉后柱头花粉数量。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述孔雀石绿染色液是由0.1%孔雀石绿溶液与0.85%-l.15%NaCl溶液按1:400的体积比混合配制而成。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤I)中染色时间为15h，染色温度为37°C，以200rpm转速进行摇床震荡染色。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中利用超声波细胞破碎仪破碎柱头组织所设定的程序如下:全程超声时间60s，超声时间60s，间歇时间Os，温度保护设定为50°C，超声功率100W，变幅杆规格为Φ6。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中收集花粉所用真空抽滤瓶的过滤杯容积为300mL，集液瓶容积为2000mL，主体材质为硼砂玻璃，砂芯过滤基座材质为磨砂玻璃，过滤砂芯直径为20mm ;滤膜材质为尼龙,滤膜孔径为10-30 μ m,滤膜形状为20mm<直径< 25mm的圆形,或20mm <边长< 25mm的正方形；使用时，将合并液倒入过滤杯中，经真空抽滤，花粉粒吸附于滤膜上，残余液体流经滤膜和过滤砂芯，收集于集液瓶中。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述开花作物为桃。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中采用ImageJ软件统计滤膜上花粉粒数量时，目标颗粒色彩参数设定范围为:色彩值120-150，饱和度70-255，亮度0-255，目标颗粒大小设定值为40-80，圆形轮廓设定值为0.5-0.8。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中滤膜孔径为20μ m。
10.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，开花作物花期授粉方式为昆虫传粉。
【文档编号】G01N1/30GK103868842SQ201410047329
【公开日】2014年6月18日申请日期:2014年2月11日优先权日:2014年2月11日
【发明者】张红, 安建东, 黄家兴, 周志勇, 盖琴宝申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所