一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法与流程

本发明涉及农业生物技术研究领域，特别是提供一种对落地生根的毛状根进行快速诱导和扩繁，并对调控落地生根相关性状基因的转化提供了快速准确的研究方法。

背景技术：

落地生根(bryohyllmpinnatum)又名灯笼花，隶属景天科(crassulaceae)落地生根属(bryohyllm)，为多年生肉质草本植物，是一种重要的中药材，全草可入药,可解毒消肿，活血止痛，拔毒生肌，其中含有大量丰富的化学成分,除具有观赏价值外,还具有广泛的药理作用,具有巨大的开发应用价值。在落地生根的繁育和开发研究中，对落地生根中基因的克隆和基因功能验证就尤为重要。研究表明，落地生根在进行基因功能验证的方法中，一般采用拟南芥或者诱导愈伤再生，生长周期较长且转化效率较低。因此对落地生根毛状根进行快速诱导和提高基因转化效率十分必要。

落地生根外植体用发根农杆菌诱导，其中发根农杆菌菌种是关键物质。a4是发根农杆菌的一种，已有文献报道可以利用a4农杆菌诱导植物发根。发根农杆菌诱导植物产生毛状根是一个复杂的过程，与之含有的ri质粒有着密切的关系，主要是由ri质粒中ori区、vir区及t-dna区三部分共同作用的结果。本发明研究了a4发根农杆菌对落地生根的诱导时间和浓度，培养时间等，并且构建了转化的带有gus报告基因的a4发根农杆菌，和对转化的毛状根进行了gus染色。通过实验研究发现野生型和转化的a4发根农杆菌最合适的od600值，能使落地生根高效诱导出毛状根，并能带有gus基因而染成蓝色。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种直观、经济、简便的快速诱导落地生根毛状根以及提高转基因效率的方法，以便应用于落地生根毛状根诱导，构建了转化的带有gus报告基因的a4发根农杆菌，并对转化的毛状根进行了gus染色鉴定以探究转化效率。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法，包括以下步骤：

（1）将无菌的2-3周龄的外植体（落地生根苗）分别用侵染液a和侵染液b侵染处理5-10分钟，所述侵染液a为野生型a4发根农杆菌，侵染液b为转入gus报告基因的a4发根农杆菌；

（2）将侵染后的外植体置于无抗ms固体培养基上，黑暗条件下进行共培养24-48小时；

（3）将外植体转移到有抗ms固体培养基中进行共培养，2-3周以后外植体分化形成毛状根；

（4）剪下毛状根，在有抗ms固体培养基上进行筛选培养，两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根；

（5）再在有抗ms固体培养基上进行继代培养，得到脱毒的落地生根毛状根；

（6）剪取毛状根，在ms液体培养基上进行扩大培养，得到大量的落地生根毛状根；

（7）用b侵染液诱导出的落地生根毛状根进行gus染色探究转化效率。

作为更为具体的实施方式，步骤（1）中，所述侵染液a由50mlod600值为0.8的农杆菌a4进行离心，用等体积ms液体进行重悬得到。

作为更为具体的实施方式，步骤（1）和步骤（7）中，所述侵染液b由50mlod600值为0.8带有gus报告基因的农杆菌a4进行离心，用等体积ms液体进行重悬得到。

作为优化的实施方式，步骤（2）和步骤（3）中，所述共培养温度为25℃。

作为优化的实施方式，步骤（3）和步骤（4）中，所述有抗ms固体培养基为100mg/ml头孢的ms固体培养基。

作为优化的实施方式，步骤（5）中，所述有抗ms固体培养基为含有50mg/ml头孢的ms固体培养基。

作为优化的实施方式，步骤（5）中，所述继代培养次数为2-3次。

作为优化的实施方式，步骤（4）和步骤（6）中，所述毛状根的剪取长度为2-3cm。

本发明采用od600值为0.8的野生型a4发根农杆菌对落地生根进行诱导，能高效诱导出大量毛状根；诱导出的毛状根中带有gus报告基因，能被染成蓝色。本发明采用的化学染色方法简便直观，能快速探究出落地生根的诱导转化效率。本发明具有操作简单，分析速度快，使用试剂价格低廉等优点。

具体实施方式

下面给出本发明的实施例，以详细说明本发明。

实施例1：一种快速高效诱导大叶落地生根毛状根的方法，包括步骤：

（1）侵染液a：由50mlod600值为0.8的a4农杆菌进行离心并用等体积ms液体进行重悬得到，混匀备用；

（2）侵染液b：50mlod600值为0.8的带有gus报告基因的a4农杆菌进行离心并用等体积ms液体进行重悬得到，混匀备用；

（3）取两瓶2周龄的大叶落地生根，分别剪段，一组加入到50毫升侵染液a中，使外植体完全浸泡在液体中，侵染5-10分钟。另外一组加入到50毫升侵染液b中，同样侵染5-10分钟；

（4）置于无抗ms固体培养基上，25°c条件下暗培养48h；

（5）共培养结束以后，转移至含有100mg/ml头孢的ms固体培养基，两周到三周以后外植体分化形成毛状根；

（6）剪取2-3cm毛状根，在加入100mg/ml头孢的ms固体培养基上进行筛选培养，两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根。再在含50mg/ml头孢的ms固体培养基上进行继代培养。继代培养2-3次以后，得到脱毒的落地生根毛状根；

（7）剪取2-3cm毛状根，在ms液体培养基上进行扩大培养，一月后得到生长快,侧根分支多的大叶落地生根毛状根；

（8）对b侵染液侵染并培养的落地生根毛状根进行gus染色发现能够染上颜色，且变蓝，根据颜色判断转化效率。

实施例2：一种快速高效诱导棒叶落地生根毛状根的方法，包括步骤：

（1）侵染液a：由50mlod600值为0.8的a4农杆菌进行离心并用等体积ms液体进行重悬得到，混匀备用。

（2）侵染液b：50mlod600值为0.8的带有gus报告基因的a4农杆菌进行离心并用等体积ms液体进行重悬得到，混匀备用。

（3）取两瓶2周龄的棒叶落地生根，分别剪段。一组加入到50毫升侵染液a中，使外植体完全浸泡在液体中，侵染5-10分钟。另外一组加入到50毫升侵染液b中，同样侵染5-10分钟。

（4）置于ms固体培养基上，25°c条件下暗培养48h。

（5）共培养结束以后，转移至含有100mg/ml头孢的ms固体培养基，两周到三周以后外植体分化形成毛状根。

（6）剪取2-3cm毛状根，在加入100mg/ml头孢的ms固体培养基上进行筛选培养。两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根。在含50mg/ml头孢的ms固体培养基上进行继代培养。继代培养2-3次以后，得到脱毒的落地生根毛状根。

（7）剪取2-3cm毛状根，在ms液体培养基上进行扩大培养。得到生长快,侧根分支多的棒叶落地生根毛状根。

（8）对b侵染液侵染并培养的落地生根毛状根进行gus染色发现能够染上颜色，且变蓝，根据颜色判断转化效率。

还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。

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