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马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44

来源：花匠小妙招时间：2025-01-08 06:12

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910283648.7 (22)申请日 2019.04.10 (71)申请人甘肃农业大学地址 730000 甘肃省兰州市安宁区营门村1 号 (72)发明人刘玉汇李元铭王丽张俊莲刘震 (74)专利代理机构北京科家知识产权代理事务所(普通合伙) 11427 代理人陈娟 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子 StMYB44-1及应用 (57)摘要本。

2、发明公开了马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1及应用， StMYB44-1的基因序列如SEQIDNO.1所示。植物材料选择；试剂的选择； RNA提取及qPCR；表达载体的构建；根据马铃薯数据库的设计引物， StMYB44-1基因序列克隆，以cDNA为模板，通过PCR扩增，从马铃薯品种黑美人的薯肉中获得了StMYB44-1的完整编码序列。本发明发现了高温下抑制马铃薯块茎花色素苷合成的转录因子StMYB44-1，本发明为阐明温度影响下马铃薯块茎花色素苷的调控机制，并以此为基础改良马铃薯花色素苷的含量具有重要的意义。权利要求书1页说明书5页序。

3、列表1页附图3页 CN 109988772 A 2019.07.09 CN 109988772 A 1.马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1，其特征在于： StMYB44-1的基因序列如SEQ IDNO.1所示。 2.马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的制备方法，其特征在于：制备方法包含以下步骤：步骤一、植物材料选择，选择四倍体紫色马铃薯品种 “黑美人” 种植于20cm直径的花盆中，培养于21/17(昼/夜)的光照培养箱中，光照强度为200 mol m-2s-1 16小时以及8小时黑暗培养。植株生长一个月后，将植株转移至26/22(昼。

4、/夜)的光照培养箱中，对照仍在21/17的光照培养箱中继续培养，待块茎成熟后，取六个新鲜块茎，用手术刀小心地取皮，并将薯肉切成小块，将皮和肉立即在液氮中冷冻并放置在-80冰箱中；步骤二试剂的选择，大肠杆菌DH5 感受态细胞、各种限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司； PureLink Plant RNA Reagent Kit购自美国Invitrogen生命技术有限公司；其中QuantiTect Reverse Transcription Kit购自Qiagen公司； DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根公司；其他生化试剂均。

5、为国产分析纯；步骤三、 RNA提取及qPCR，用PureLink Plant RNA Reagent Kit试剂盒分别抽提马铃薯薯皮薯肉的总RNA，通过使用Nanodrop ND-1000分光光度计，测定RNA纯度和浓度，并用1 琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，利用QuantiTect Reverse Transcription Kit试剂盒进行反转录，其中以Oligo(dT)20为引物,下合成cDNA第一链，并在-20下保存；其中qPCR反应体系为95预变性30s、 95变性5s、 60退火30s、 40个循环，扩增产物用1琼脂糖凝胶电泳检测，内参基因为StEF-1 。

6、(AB061263)，相对表达量用Ct(2- Ct)方法测定，引物为 StMYB44-1qF5 -GTGATTCCAGTCTTTCGGGTTTTCC-3； StMYB44-1qR5 -AGGAGGAAGAGGGAAAATCCCG-3；步骤四、表达载体的构建根据马铃薯数据库的PGSC0003DMG400003316设计引物，根据序列设计引物克隆 StMYB44-1的全长编码序列，通过使用In-Fusion HD克隆试剂盒将具有EcoRI和HindIII限制性位点的PCR产物克隆到二元载体pSAK277的多克隆位点中；步骤五、 StMYB44-1基因序列克隆，以cDNA为模板。

7、，通过PCR扩增，从马铃薯品种HM的薯肉中分别获得了长度为954bp的StMYB44-1的完整编码序列。 3.马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的应用，其特征在于：高温条件下， StMYB44-1在马铃薯紫色品种黑美人的白肉中高表达，在高温或对照下的紫色薯皮和薯肉中表达较低， StMYB44-1对花色素苷生物合成具有一定的抑制效果。权利要求书 1/1 页 2 CN 109988772 A 2 马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1及应用技术领域 0001 本发明涉及基因技术领域，具体为马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44- 1及应用。。

8、背景技术 0002 花色素苷是决定植物颜色的黄酮类物质，对植物生长和人类健康具有重要的作用。花色素苷是植物次生代谢过程中产生的黄酮类物质，是植物中最重要、分布最广泛的一类有色物质，赋予植物各种颜色。它们不仅使植物产生丰富的色彩，还在昆虫的传粉，生长素运输，保护叶片免受紫外线伤害，抑制病虫害等方面有重要的作用。作为天然色素，花色素苷可应用于食品、化妆品等行业，同时它被证明具有抗氧化、抗病毒、延缓机体组织衰老、抑制炎症和过敏、预防心血管疾病、提高人体免疫力、抗癌等作用，其医药价值更是备受关注。 MYB类转录因子参与花色素苷合成过程，对植物颜色的。

9、形成具有重要作用。 0003 大多数的MYB转录因子为转录激活子，也有少数MYB转录因子能够抑制花色素苷的积累(转录抑制子)，但是，对于MYB转录因子调控花色素苷合成的机理认识还非常有限，因此，研究MYB转录激活子和抑制子共同调控花色素苷合成的分子机理具有重要的理论意义。马铃薯(Solanum Tuberosum L.)是世界第三大粮食作物，种植潜力大，能够缓解资源环境压力，自身营养价值高，有助于改善和丰富居民膳食营养结构，马铃薯也是甘肃省第三大经济作物，是甘肃农业经济发展的重要支柱产业。马铃薯具有非常丰富的种质资源，其薯肉和薯皮具有白、红、紫等一系列。

10、色泽。彩色马铃薯不仅外形美观，而且富含花色素苷，与其他色素源作物相比具有明显的发展优势：种植成本低，对环境适应能力强，食用方便，易于生产和加工，长时间贮藏后色素含量无明显下降，具有较高的块茎产量。同时四倍体彩色马铃薯所含色素主要是酰基化花色素苷，其提取物较葡萄、紫胡萝卜等的色素提取物具有更好的稳定性和抗氧化活性，因此，马铃薯是获得优质花色素苷的理想来源，并可作为新颖的自然着色剂和抗氧化剂资源，广泛应用于食品工业和医药研究。目前对于MYB转录因子调控花色素苷合成的机理认识还非常有限，尤其是马铃薯块茎花色素苷合成的抑制转录因子还未被发掘。发明内容。

11、 0004 本发明的目的在于提供马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。 0005 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1，其基因序列如SEQ IDNO.1所示。 0006 本发明马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的制备方法包含以下步骤：步骤一、植物材料选择，选择四倍体紫色马铃薯品种 “黑美人” 种植于20cm直径的花盆中，培养于21/17(昼/夜)的光照培养箱中，光照强度为200 mol m-2s-1 16小时以及8小时黑暗培养。植株生长一个。

12、月后，将植株转移至26/22(昼/夜)的光照培养箱中，对照仍在说明书 1/5 页 3 CN 109988772 A 3 21/17的光照培养箱中继续培养。待块茎成熟后，每个处理下的取六个新鲜块茎，用手术刀小心地取皮，并将薯肉切成小块，将皮和肉立即在液氮中冷冻并放置在-80冰箱中。 0007 步骤二试剂的选择，大肠杆菌DH5 感受态细胞、各种限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司； PureLink Plant RNA Reagent Kit购自美国 Invitrogen生命技术有限公司；其中QuantiTect Reverse。

13、 Transcription Kit购自Qiagen 公司； DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根公司；其他生化试剂均为国产分析纯； 0008 步骤三、 RNA提取及qPCR，用PureLink Plant RNA Reagent Kit试剂盒分别抽提马铃薯薯皮薯肉的总RNA，通过使用Nanodrop ND-1000分光光度计，测定RNA纯度和浓度，并用 1琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，利用QuantiTect Reverse Transcription Kit试剂盒进行反转录，其中以Oligo(dT)20为引物,下合成cDNA第一链，并在-20下保存；其中qPCR 反应体系为。

14、95预变性30s、 95变性5s、 60退火30s、 40个循环，扩增产物用1琼脂糖凝胶电泳检测，内参基因为StEF-1 (AB061263)，相对表达量用Ct(2- Ct)方法测定，引物为 0009 StMYB44-1qF5 -GTGATTCCAGTCTTTCGGGTTTTCC-3； 0010 StMYB44-1qR5 -AGGAGGAAGAGGGAAAATCCCG-3； 0011 步骤四、表达载体的构建，根据马铃薯数据库的PGSC0003DMG400003316设计引物根据序列设计引物克隆StMYB44-1的全长编码序列，通过使用In-Fusion HD克隆试剂盒 (Cl。

15、ontech Laboratories， Inc.， Mountain View， CA)将具有EcoRI和HindIII限制性位点的 PCR产物克隆到二元载体pSAK277的多克隆位点(MCS)中； 0012 步骤五、 StMYB44-1基因序列克隆，以cDNA为模板，通过PCR扩增，从马铃薯品种黑美人的薯肉中获得了长度为954bp的StMYB44-1的完整编码序列。 0013 马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的应用，高温条件下，在马铃薯黑美人品种的白肉中高表达，在高温或对照下的紫色薯皮和薯肉中表达较低，因此StMYB44-1 对花色素苷生物合成具有一定的。

16、抑制效果。 0014 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明发现了高温下抑制马铃薯块茎花色素苷合成的转录因子StMYB44-1，本发明为阐明温度影响下马铃薯块茎花色素苷的调控机制，并以此为基础改良马铃薯花色素苷的含量具有重要的意义。附图说明 0015 图1为不同温度处理下薯块表型及花色素苷含量图； 0016 图2为StMYB44-1， StMYB44-2， AtMYB44以及和其它类黄酮合成相关抑制子氨基酸序列比对图； 0017 图3为StMYB44-1和StMYB44-2在白色薯肉中高表达图； 0018 图4为StMYB44-1和StMYB44-2转录因子的功能验证图。。

17、具体实施方式 0019 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。说明书 2/5 页 4 CN 109988772 A 4 0020 实施例：马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的制备方法为： 1、材料与方法 0021 1.1植物材料和生长条件 0022 四倍体紫色马铃薯栽培品种 “黑美人” (HM，紫色皮和紫色果肉)种植于20cm直。

18、径的花盆中，培养于21/17(昼/夜)的光照培养箱中，光照强度为200 mol m-2s-1 16小时以及8小时黑暗培养。植株生长一个月后，将植株转移至26/22(昼/夜)的光照培养箱中，对照仍在21/17的光照培养箱中继续培养。待块茎成熟后，每个处理下的取六个新鲜块茎，用手术刀小心地取皮，并将薯肉切成小块，将皮和肉立即在液氮中冷冻并放置在-80冰箱中。 0023 1.2试剂 0024 大肠杆菌DH5 感受态细胞、各种限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司； PureLink Plant RNA Reagent Kit购。

19、自美国Invitrogen生命技术有限公司； QuantiTect Reverse Transcription Kit购自Qiagen公司； DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根公司；其他生化试剂均为国产分析纯。 0025 1.3 RNA提取及qPCR 0026 用PureLink Plant RNA Reagent Kit试剂盒分别抽提马铃薯薯皮薯肉的总RNA。通过使用Nanodrop ND-1000分光光度计(NanoDrop技术，美国)测定RNA纯度和浓度，并用 1琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。利用QuantiTect Reverse Transcription Kit试剂盒进。

20、行反转录，其中以Oligo(dT)20为引物,在M-MLV反转录酶作用下合成cDNA第一链，并在- 20下保存。 qPCR反应体系为95预变性30s、 95变性5s、 60退火30s、 40个循环。 0027 扩增产物用1琼脂糖凝胶电泳检测，内参基因为StEF-1 (AB061263)，相对表达量用Ct(2- Ct)方法测定，引物为 0028 StMYB44-1qF5 -GTGATTCCAGTCTTTCGGGTTTTCC-3 ； 0029 StMYB44-1qR5 -AGGAGGAAGAGGGAAAATCCCG-3 ； 0030 1.4表达载体的构建 0031 根据马铃薯。

21、数据库 ( P o t a t o G e n o m i c s R e s o u r c e h t t p : / / solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml)的PGSC0003DMG400003316设计引物MYB44-1F(5 -3 CTAGTGGATCCAAAGAATTC ATGGCGGCGATTACGCAGA)/MYB44-1R(5 -3 GAAGTACTCTCGAGAAGCTT TTACTCAATCTTGCTGATGCCAATAC)克隆StMYB44-1的全长编码序列。通过使用In-Fusion HD克隆。

22、试剂盒(Clontech Laboratories， Inc.， Mountain View， CA)将具有EcoRI和HindIII限制性位点的PCR产物克隆到二元载体pSAK277的多克隆位点(MCS) 中。 0032 1.5转基因烟草中花色素苷平均含量的分析 0033 将马铃薯薯肉样品在液氮中充分研磨，取0.5g转至5ml的离心管，加入酸性甲醇提取液至满管，混匀， 4下黑暗放置24h，离心，上清液转入25ml的容量瓶，残渣中加入酸性甲醇提取液，悬浮混匀， 4下黑暗放置12h，离心取上清液。重复以上步骤一次，最后用浸提液定容至25ml。在400800nm可见光。

23、的波长范围内进行紫外-可见光吸收光谱的扫描，确定其在可见光区的最大吸收波长。取1ml花色苷提取液，分别加入PH1.0氯化钾缓冲液和PH 4.5醋酸钠缓冲液9ml，室温平衡1h，蒸馏水做空白对照，分别在 max和 700下测定吸光值，说明书 3/5 页 5 CN 109988772 A 5 代入公式计算花色素苷总含量，最后各求其花色素苷含量平均值。 0034 将马铃薯薯肉样品在液氮中充分研磨，取0.5g转至5ml的离心管，加入酸性甲醇提取液至满管，混匀， 4下黑暗放置24h，离心，上清液转入25ml的容量瓶，残渣中加入酸性甲醇提取液，悬浮混匀， 4下黑暗放置1。

24、2h，离心取上清液。重复以上步骤一次，最后用浸提液定容至25ml。在400800nm可见光的波长范围内进行紫外-可见光吸收光谱的扫描，确定其在可见光区的最大吸收波长。取1ml花色苷提取液，分别加入PH1.0氯化钾缓冲液和PH 4.5醋酸钠缓冲液9ml，室温平衡1h，蒸馏水做空白对照，分别在 max和 700下测定吸光值，代入公式计算花色素苷总含量，最后各求其花色素苷含量平均值。 0035 2、结果 0036 2.1高温降低了马铃薯薯皮和薯肉中的花色素苷含量 0037 在21/17(对照)的HM紫色薯皮和薯肉中花色素苷浓度分别为95 .2 5.13mg100g-1 。

25、FW和49.604.06mg100g-1 FW。高温显著降低了薯皮和薯肉中花色素苷的总含量，特别是维管束周围的薯肉变白，没有检测到花色素苷，而紫色薯肉的花色素苷含量降为25.832.82mg100g-1FW，相比对照减少了47.9(图1)，图1中CS：对照薯皮， CF：对照薯肉， HS：高温薯皮， HPF：高温下紫色薯肉， HWF：高温下白色薯肉； 0038 2.2 StMYB44-1基因序列克隆及分析 0039 以cDNA为模板，通过PCR扩增，从马铃薯品种HM的薯肉中获得了长度为954bp (StMYB44-1)的完整编码序列。 0040 StMYB44-1。

26、蛋白与AtMYB44(AT5G67300)序列的同源性为别为56.8。如图2所示，在StMYB44中未发现bHLH相互作用基序(DELx2RKx3Lx6Lx3R)的保守氨基酸特征。在蛋白质的 c - 末端区域， S G 2 2 组含有保守序列 2 2 .1 ( T G L Y M S P x S P) 和 2 2 .3 (GxFMxVVQEMIxxEVRSYM)，进一步分析显示另一个保守基序22.2(D/EPP/MTxLxLSLP)存在于保守序列22.1和22.3之间。其中22.2与EAR(LXLXL)序列部分保守。 StMYB44-1具有完整的 EAR m。

27、otif(LXLXL)。 2.3 StMYB44-1在白色薯肉中高表达 0041 PCR分析证实StMYB44-1在白肉中高表达，而在高温或对照下的紫色薯皮和薯肉肉中表达较低(图3)。 0042 2.4由于高温下StMYB44s在块茎白色薯肉中高度表达，我们在烟草和本塞姆氏烟草叶中(N.tabacum和N.benthamiana)对两个基因的功能进行验证(图4)。烟草叶片中的瞬时表达结果表明，单独注射马铃薯花色素苷合成MYB转录激活子StAN1-R0， StAN1-R1和 StAN1-R3(Liu et al， 2016)时会引起叶片中花色素苷的积累，当StAN1-R0/StA。

28、N1-R1/ StAN1-R3与StMYB44-1共同注射时可看到颜色被明显抑制， (图4)，表明StMYB44-1能够抑制花色素苷的积累。当StAN1-R1与StMYB44-2共同注射时，与单独注射StAN1-R1相比，花色素苷积累也受到抑制，但抑制程度远不如StMYB44-1(图4)。 0043 我们利用了与荧光素酶报告基因融合的马铃薯DFR基因的启动子prom-3-StDFR (Liu etal， 2016)来检测StMYB44-1和StMYB44-2对花色素苷合成途径结构基因的影响。 StAN1-R0/StAN1-R1/StAN1-R3与StbHLH1共同注射能够激活pr。

29、om-3-StDFR启动子，而与 StMYB44-1或StMYB44-2共同注射后抑制了prom-3-StDFR的活性。 StMYB44-1的抑制能力强于StMYB44-2(图4)。这些结果表明StMYB44-1和StMYB44-2是花色素苷生物合成的抑制子，而StMYB44-1具有更强的抑制能力可能是由于存在EAR序列。说明书 4/5 页 6 CN 109988772 A 6 0044 工作原理：尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附。

30、权利要求及其等同物限定。说明书 5/5 页 7 CN 109988772 A 7 序列表甘肃农业大学马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1及应用 2019-04-10 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 756 DNA StMYB44-1 1 atggattttt ttaacagatg ttcaacttca tcttcttctt ccgaatcatc ttcatcagaa 60 tcttcgcttt cgggtaaaaa tccgaataaa tctgaaagaa taaaggggcc atggagcgct 120 gaagaagata agattttaa。

31、c gaaacttgtt gagcgttacg gagctcggaa ttggtctttg 180 attagtaaat acataaaagg taggtccggc aaatcctgcc ggctccggtg gtgtaatcag 240 ttaagtccta atgttgaaca ccggccattt tctccggcgg aggatgaagc tattttagct 300 gctcatgcta aatatgggaa ccgatgggcc accattgccc gattacttcc gggtcggact 360 gataatgcgg ttaaaaatca ctggaattcg acattaa。

32、aga ggcgttatca gcaattaatt 420 cagcagcaaa atcagaaccc gattgtgttt tctgatgtga aaattaatgg gtcaggatcc 480 ggatccggat ctggattcgg gtcgtgtatg gagtatttaa atgttgatga gagtccaaaa 540 gggaataata ataataatta cgctgttacg aataattgta gcggtgaatt tgatgatccg 600 atgacgactt tgtcacttgc gccgccggga atgggcggag atgagttgcc ggagaagaaa 660 acggagagtt ttccggaggg attttgggat gtgatgagag gtgttattgc tagagaagtg 720 agagaatatg ttgcttctac ggggtttcct aattaa 756 序列表 1/1 页 8 CN 109988772 A 8 图1 说明书附图 1/3 页 9 CN 109988772 A 9 图2 图3 说明书附图 2/3 页 10 CN 109988772 A 10 图4 说明书附图 3/3 页 11 CN 109988772 A 11 。