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辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-01-05 15:00

1、(10)申请公布号 CN 102102100 A (43)申请公布日 2011.06.22 CN 102102100 A *CN102102100A* (21)申请号 201010175658.8 (22)申请日 2010.05.12 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人中国热带农业科学院环境与植物保护研究所地址 571737 海南省儋州市宝岛新村 (72)发明人黄俊生景晓辉汪军吴伦英吴琳薛玉潇朱利林杨腊英 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅任凤华 (54) 发明名称辅

2、助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对 (57) 摘要本发明公开了一种辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对。本发明提供了引物对甲和引物对乙组成的专用引物；所述引物对甲由序列表的序列1所示DNA 和序列表的序列2 所示 DNA组成；所述引物对乙由序列表的序列 3 所示 DNA 和序列表的序列 4 所示 DNA 组成。所述专用引物可用于辅助鉴别根结线虫。本发明提供的方法，不仅能准确区分四种常见的根结线虫，而且灵敏度高，可利用单个卵囊或单条二龄幼虫鉴定根结线虫种类，可以直接从病组织中分离获得，无需纯化培养，可以大大缩短线虫纯化培养时间，提高检测效率。 (51)I

3、nt.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 2 页说明书 6 页序列表 2 页附图 2 页 CN 102102103 A1/2 页 2 1. 序列表的序列 3 所示 DNA 和序列表的序列 4 所示 DNA 组成的引物对乙。 2. 权利要求 1 所述引物对乙在辅助鉴别南方根结线虫中的应用。 3. 一种辅助鉴别南方根结线虫的方法，包括如下步骤： (1) 提取待测根结线虫的基因组 DNA ； (2) 以基因组 DNA 为模板，用权利要求 1 所述引物对乙进行 PCR 扩增；如果得到 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫；

4、如果没有得到 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的非南方根结线虫。 4. 引物对甲和引物对乙组成的专用引物；所述引物对甲由序列表的序列 1 所示 DNA 和序列表的序列 2 所示 DNA 组成；所述引物对乙由序列表的序列 3 所示 DNA 和序列表的序列 4 所示 DNA 组成。 5. 权利要求 4 所述专用引物在辅助鉴别根结线虫中的应用。 6. 一种辅助鉴别根结线虫的方法，包括如下步骤： (1) 提取待测根结线虫的基因组 DNA ； (2) 以基因组 DNA 为模板，用权利要求 4 所述专用引物进行 PCR 扩增；用所述引物对乙进行PCR扩增时；如果得到PCR

5、扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫；如果没有得到 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的非南方根结线虫；用所述引物对甲进行PCR扩增时；如果得到1.6kb-1.8kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫或爪哇根结线虫；如果得到1.0kb-1.2kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的花生根结线虫；如果得到0.4kb-0.6kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的北方根结线虫。 7. 序列表的序列 1 所示 DNA 和序列表的序列 2 所示 DNA 组成的引物对甲。 8. 一种辅助鉴别根结线虫的方法，包括如下步骤： (1) 提取

6、待测根结线虫的基因组 DNA ； (2) 以基因组 DNA 为模板，用权利要求 7 所述引物对甲进行 PCR 扩增；如果得到 1.6kb-1.8kb 的 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫或爪哇根结线虫；如果得到 1.0kb-1.2kb 的 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的花生根结线虫；如果得到 0.4kb-0.6kb 的 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的北方根结线虫。 9. 如权利要求 3、 6 或 8 所述的方法，其特征在于：权利要求 6 或 8 的步骤 (1) 中：所述待测根结线虫为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫

7、或北方根结线虫；权利要求 3、 6 或 8 中：所述基因组 DNA 取自成虫、幼虫或卵囊；当基因组 DNA 取自成虫或幼虫、所述 PCR 所用的引物对为所述引物对甲时，所述 PCR 的反应程序为： 94预变性4min ； 94变性1min、 48退火1min、 72延伸2min，进行40个循环；最后 72保温 5min ；当基因组 DNA 取自卵囊、所述 PCR 所用的引物对为所述引物对甲时，所述 PCR 的反应程序为： 94预变性 4min ； 94变性 1min、 48退火 1min、 72延伸 2min，进行 35 个循环；最后 72保温

8、5min ；当基因组 DNA 取自成虫或幼虫、所述 PCR 所用的引物对为所述引物对乙时，所述 PCR 的反应程序为： 94预变性4min ； 94变性45S、 58退火45S、 72延伸45S，进行40个循环；权利要求书 CN 102102100 A CN 102102103 A2/2 页 3 最后 72保温 5min ；当基因组 DNA 取自卵囊、所述 PCR 所用的引物对为所述引物对乙时，所述 PCR 的反应程序为： 94预变性 4min ； 94变性 45S、 58退火 45S、 72延伸 45S，进行 35 个循环；最后 72保温 5min ；

9、用所述引物对乙进行 PCR 扩增得到的 PCR 扩增产物为 400bp-600bp。 10. 权利要求 1 至 9 中任一所述方法在辅助鉴定根结线虫染病植物中的应用。权利要求书 CN 102102100 A CN 102102103 A1/6 页 4 辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对技术领域 0001 本发明涉及一种辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对。背景技术 0002 植物寄生线虫病是一种世界范围内普遍发生的植物病害，危害 3000 多种植物。全球每年因线虫造成的损失高达 1000 多亿美元。植物根结线虫病害在我国发生比较广泛，尤其在南方地区危害比较严重，如香

10、蕉根结线虫、西瓜根结线虫、辣椒根结线虫。由于根结线虫种间存在显著的致病性差异，作物抗性和植物检疫等成功的应用依赖于对根结线虫种类进行快速、准确的鉴定，因而，采取可靠的分类鉴定方法是植物线虫病害防治的基础。 0003 目前，国内外学者常利用mtDNA-RFLP、 rDNA-ITS及SCAR等方法鉴定根结线虫的种类，然而因其各自的局限性 (mtDNA-RFLP 耗时较长、 rDNA-ITS 精确度不高、 SCAR 灵敏度不强 ) 而不能达到快速、准确鉴定的目的。发明内容 0004 本发明的目的是提供一种辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对。 0005 本发明保护序列表的

11、序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对乙。所述引物对乙可用于辅助鉴别南方根结线虫。 0006 本发明还保护一种辅助鉴别南方根结线虫的方法，包括如下步骤： 0007 (1) 提取待测根结线虫的基因组 DNA ； 0008 (2)以基因组DNA为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增；如果得到PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫；如果没有得到 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的非南方根结线虫。所述 PCR 扩增产物具体可为 400bp-600bp。 0009 本发明还保护引物对甲和引物对乙组成的专用引物；所述引物对甲由序列表的序列 1 所示

12、DNA 和序列表的序列 2 所示 DNA 组成；所述引物对乙由序列表的序列 3 所示 DNA 和序列表的序列 4 所示 DNA 组成。所述专用引物可用于辅助鉴别根结线虫。 0010 本发明还保护一种辅助鉴别根结线虫的方法，包括如下步骤： 0011 (1) 提取待测根结线虫的基因组 DNA ； 0012 (2) 以基因组 DNA 为模板，用所述专用引物进行 PCR 扩增； 0013 用所述引物对乙进行PCR扩增时：如果得到PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫；如果没有得到 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的非南方根结线虫； 0014 用所述引物对甲进行

13、PCR扩增时：如果得到1.6kb-1.8kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫或爪哇根结线虫；如果得到1.0kb-1.2kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的花生根结线虫；如果得到0.4kb-0.6kb的PCR扩增产物，待测根结线虫为候选的北方根结线虫。 0015 用所述引物对乙进行 PCR 扩增得到的 PCR 扩增产物具体可为 400bp-600bp。 0016 本发明还保护序列表的序列 1 所示 DNA 和序列表的序列 2 所示 DNA 组成的引物对说明书 CN 102102100 A CN 102102103 A2/6 页 5 甲。所述引

14、物对甲可用于辅助鉴别根结线虫。 0017 本发明提供了另一种辅助鉴别根结线虫的方法，包括如下步骤： 0018 (1) 提取待测根结线虫的基因组 DNA ； 0019 (2) 以基因组 DNA 为模板，用所述引物对甲进行 PCR 扩增；如果得到 1.6kb-1.8kb 的 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的南方根结线虫或爪哇根结线虫；如果得到 1.0kb-1.2kb 的 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的花生根结线虫；如果得到 0.4kb-0.6kb 的 PCR 扩增产物，待测根结线虫为候选的北方根结线虫。 0020 以上任一所述辅助鉴别根结线虫的方法中： 0

15、021 所述待测根结线虫为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫或北方根结线虫。 0022 所述基因组 DNA 取自成虫、幼虫或卵囊。 0023 当基因组 DNA 取自成虫或幼虫、所述 PCR 所用的引物对为所述引物对甲时，所述 PCR 的反应程序为： 94预变性 4min ； 94变性 1min、 48退火 1min、 72延伸 2min，进行 40 个循环；最后 72保温 5min。当基因组 DNA 取自卵囊、所述 PCR 所用的引物对为所述引物对甲时，所述 PCR 的反应程序为： 94预变性 4min ； 94变性 1min、 48退火 1min、 72 延

16、伸 2min，进行 35 个循环；最后 72保温 5min。 0024 当基因组 DNA 取自成虫或幼虫、所述 PCR 所用的引物对为所述引物对乙时，所述 PCR 的反应程序为： 94预变性 4min ； 94变性 45S、 58退火 45S、 72延伸 45S，进行 40 个循环；最后 72保温 5min。当基因组 DNA 取自卵囊、所述 PCR 所用的引物对为所述引物对乙时，所述 PCR 的反应程序为： 94预变性 4min ； 94变性 45S、 58退火 45S、 72延伸 45S，进行 35 个循环；最后 72保温 5min ； 0025 以上任一所述

17、方法在均可用于辅助鉴定根结线虫染病植物。 0026 应用本发明的引物对辅助鉴定时，基因组 DNA 既可以取自线虫成虫、线虫幼虫、线虫卵囊，也可以取自感染根结线虫的植物的根结 ( 根瘤 )。 0027 为了克服现有的方法不能快速、准确地鉴定根结线虫的不足，本专利提供一种鉴定根结线虫的方法，该 PCR 方法不仅能准确区分四种常见的根结线虫，而且灵敏度高，可利用单个卵囊或单条二龄幼虫鉴定根结线虫种类，可以直接从病组织中分离获得，无需纯化培养，可以大大缩短线虫纯化培养时间，提高检测效率。附图说明 0028 图 1 为实施例 2 中采用引物对甲的 PCR 扩增产物的电

18、泳图。 0029 图 2 为实施例 2 中采用引物对乙的 PCR 扩增产物的电泳图。 0030 图 3 为实施例 5 中采用引物对甲的 PCR 扩增产物的电泳图。 0031 图 4 为实施例 5 中采用引物对乙的 PCR 扩增产物的电泳图。具体实施方式 0032 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的，如无特殊说明，均为质量百分含量。以说明书 CN 102102100 A CN 102102103 A3/6 页

19、6 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 0033 8个根结线虫种群： 5个南方根结线虫种群(分离自5个染病植株) ； 1个爪哇根结线虫种群； 1 个花生根结线虫种群； 1 个北方根结线虫种群。 0034 实施例 1、引物的制备 0035 人工合成如下四条引物： 0036 #C2F3 ： 5 -GGTCAA TGTCAGAAA TTTGTGG-3 ；序列 1 ； 0037 #1108 ： 5 -TACCTTTGACCAA TCACGCT-3 ；序列 2 ； 0038 MI-F ： 5 -GGGCAAGTAAGGATGCTCTGAC-3 ；序列 3 ；

20、0039 MI-R(5 -CTTTCATAGCCACGTCGCGATC-3 ；序列 4。 0040 #C2F3 和 #1108 组成的引物对作为引物对甲， MI-F 和 MI-R 组成的引物对作为引物对乙。引物对甲针对线粒体 DNA(mtDNA) 中的 CO II 和 LrRNA 间区域。引物对乙针对食管腺蛋白基因。 0041 实施例 2、应用引物对辅助鉴别根结线虫 ( 成虫 ) 0042 一、用引物对甲辅助鉴别根结线虫 0043 1、提取单条根结线虫 ( 成虫 ) 的基因组 DNA。 0044 2、以基因组 DNA 为模板进行 PCR 反应，得到 PCR 扩增产物。 0045

21、 PCR反应体系(25L) ： 17.1l ddH20 ； 2.5l 10buffer ； 2l dNTP(2.5mM) ； 1l 引物 #C2F3(20M) ； 1l 引物 #1108(20M) ； 0.4l Taq 酶 (5U/l) ； 1l 模板。 0046 PCR 反应程序： 94预变性 4min ； 94变性 1min、 48退火 1min、 72延伸 2min，进行 40 个循环；最后 72保温 5min。 0047 3、 PCR 扩增产物进行 1 ( 含 0.5g/mL EB) 琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE，电压为 80V，电泳约 30min。在凝胶图

22、像系统 (Tanon 4500，天能科技 ( 上海 ) 有限公司 ) 上照像和保存，并用系统的自带软件 ( 天能 GIS 凝胶图像处理系统；版本 4.00，软件注册号： 0003952) 对条带大小进行分析。 0048 结果见图 1。图 1 中： M ：标准分子量； 1-5 ：南方根结线虫； 6 ：爪哇根结线虫； 7 ：花生根结线虫； 8 ：北方根结线虫； 9 ： CK( 不加模板 )。条带大小分析结果：南方根结线虫和爪哇根结线虫的 PCR 扩增产物约为 1.7kb(1.6kb-1.8kb 之间 )，花生根结线虫的 PCR 扩增产物约为 1.1

23、kb(1.0kb-1.2kb 之间 )，北方根结线虫的 PCR 扩增产物约为 0.5kb(0.4kb-0.6kb 之间 )。 0049 二、用引物对乙辅助鉴别根结线虫成虫 0050 1、提取单条根结线虫 ( 成虫 ) 的基因组 DNA。 0051 2、以基因组 DNA 为模板进行 PCR 反应，得到 PCR 扩增产物。 0052 PCR反应体系(25L) ： 17.1l ddH20 ； 2.5l 10buffer ； 2l dNTP(2.5mM) ； 1l 引物 MI-F(20M) ； 1l 引物 MI-R(20M) ； 0.4l Taq 酶 (5U/l) ； 1l 模板。 0053

24、 PCR反应程序： 94预变性4min ； 94变性45S、 58退火45S、 72延伸45S，进行 40 个循环；最后 72保温 5min。 0054 3、 PCR 扩增产物进行 1 ( 含 0.5g/mL EB) 琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE，电压为 80V，电泳约 30min。在凝胶图像系统 (Tanon 4500，天能科技 ( 上海 ) 有限公司 ) 上照像和保存，并用系统的自带软件 ( 天能 GIS 凝胶图像处理系统；版本 4.00，软说明书 CN 102102100 A CN 102102103 A4/6 页 7 件注册号： 0003

25、952) 对条带大小进行分析。 0055 结果见图 2。图 2 中： M ：标准分子量； 1-5 ：南方根结线虫； 6 ：爪哇根结线虫； 7 ：花生根结线虫； 8 ：北方根结线虫； 9 ： CK( 不加模板 )。除了南方根结线虫，其它三种根结线虫均没有得到 PCR 扩增产物。条带大小分析结果：南方根结线虫的 PCR 扩增产物约为 500bp(400b-600b 之间 )。 0056 实施例 3、应用引物对辅助鉴别根结线虫幼虫 (2 龄幼虫 ) 0057 一、用引物对甲辅助鉴别根结线虫 0058 1、提取单条根结线虫 (2 龄幼虫 ) 的基因组 DNA。 00

26、59 2、以基因组 DNA 为模板进行 PCR 反应，得到 PCR 扩增产物。 0060 PCR反应体系(25L) ： 17.1l ddH20 ； 2.5l 10buffer ； 2l dNTP(2.5mM) ； 1l 引物 #C2F3(20M) ； 1l 引物 #1108(20M) ； 0.4l Taq 酶 (5U/l) ； 1l 模板。 0061 PCR 反应程序： 94预变性 4min ； 94变性 1min、 48退火 1min、 72延伸 2min，进行 40 个循环；最后 72保温 5min。 0062 3、 PCR 扩增产物进行 1 ( 含 0.5g/mL EB) 琼

27、脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE，电压为 80V，电泳约 30min。在凝胶图像系统 (Tanon 4500，天能科技 ( 上海 ) 有限公司 ) 上照像和保存，并用系统的自带软件 ( 天能 GIS 凝胶图像处理系统；版本 4.00，软件注册号： 0003952) 对条带大小进行分析。 0063 条带大小分析结果：南方根结线虫和爪哇根结线虫的 PCR 扩增产物约为 1.7kb(1.6kb-1.8kb之间)，花生根结线虫的PCR扩增产物约为1.1kb(1.0kb-1.2kb之间)，北方根结线虫的 PCR 扩增产物约为 0.5kb(0.4kb-0.6kb 之间

28、 )。 0064 二、用引物对乙辅助鉴别根结线虫成虫 0065 1、提取单条根结线虫 (2 龄幼虫 ) 的基因组 DNA。 0066 2、以基因组 DNA 为模板进行 PCR 反应，得到 PCR 扩增产物。 0067 PCR反应体系(25L) ： 17.1l ddH20 ； 2.5l 10buffer ； 2l dNTP(2.5mM) ； 1l 引物 MI-F(20M) ； 1l 引物 MI-R(20M) ； 0.4l Taq 酶 (5U/l) ； 1l 模板。 0068 PCR反应程序： 94预变性4min ； 94变性45S、 58退火45S、 72延伸45S，进行 40 个循

29、环；最后 72保温 5min。 0069 3、 PCR 扩增产物进行 1 ( 含 0.5g/mL EB) 琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE，电压为 80V，电泳约 30min。在凝胶图像系统 (Tanon 4500，天能科技 ( 上海 ) 有限公司 ) 上照像和保存，并用系统的自带软件 ( 天能 GIS 凝胶图像处理系统；版本 4.00，软件注册号： 0003952) 对条带大小进行分析。 0070 除了南方根结线虫，其它三种根结线虫均没有得到 PCR 扩增产物。条带大小分析结果：南方根结线虫的 PCR 扩增产物约为 500bp(400b-600b

30、之间 )。 0071 实施例 4、应用引物对辅助鉴别根结线虫幼虫 ( 卵囊 ) 0072 一、用引物对甲辅助鉴别根结线虫 0073 1、提取根结线虫卵囊的基因组 DNA。 0074 2、以基因组 DNA 为模板进行 PCR 反应，得到 PCR 扩增产物。 0075 PCR反应体系(25L) ： 17.1l ddH20 ； 2.5l 10buffer ； 2l dNTP(2.5mM) ； 1l 引物 #C2F3(20M) ； 1l 引物 #1108(20M) ； 0.4l Taq 酶 (5U/l) ； 1l 模板。说明书 CN 102102100 A CN 102102103 A

31、5/6 页 8 0076 PCR 反应程序： 94预变性 4min ； 94变性 1min、 48退火 1min、 72延伸 2min，进行 35 个循环；最后 72保温 5min。 0077 3、 PCR 扩增产物进行 1 ( 含 0.5g/mL EB) 琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE，电压为 80V，电泳约 30min。在凝胶图像系统 (Tanon 4500，天能科技 ( 上海 ) 有限公司 ) 上照像和保存，并用系统的自带软件 ( 天能 GIS 凝胶图像处理系统；版本 4.00，软件注册号： 0003952) 对条带大小进行分析。 0078 条带

32、大小分析结果：南方根结线虫和爪哇根结线虫的 PCR 扩增产物约为 1.7kb(1.6kb-1.8kb之间)，花生根结线虫的PCR扩增产物约为1.1kb(1.0kb-1.2kb之间)，北方根结线虫的 PCR 扩增产物约为 0.5kb(0.4kb-0.6kb 之间 )。 0079 二、用引物对乙辅助鉴别根结线虫成虫 0080 1、提取根结线虫卵囊的基因组 DNA。 0081 2、以基因组 DNA 为模板进行 PCR 反应，得到 PCR 扩增产物。 0082 PCR反应体系(25L) ： 17.1l ddH20 ； 2.5l 10buffer ； 2l dNTP(2.5mM) ； 1

33、l 引物 MI-F(20M) ； 1l 引物 MI-R(20M) ； 0.4l Taq 酶 (5U/l) ； 1l 模板。 0083 PCR反应程序： 94预变性4min ； 94变性45S、 58退火45S、 72延伸45S，进行 35 个循环；最后 72保温 5min。 0084 3、 PCR 扩增产物进行 1 ( 含 0.5g/mL EB) 琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE，电压为 80V，电泳约 30min。在凝胶图像系统 (Tanon 4500，天能科技 ( 上海 ) 有限公司 ) 上照像和保存，并用系统的自带软件 ( 天能 GIS 凝胶图像处理系统；

34、版本 4.00，软件注册号： 0003952) 对条带大小进行分析。 0085 除了南方根结线虫，其它三种根结线虫均没有得到 PCR 扩增产物。条带大小分析结果：南方根结线虫的 PCR 扩增产物约为 500bp(400b-600b 之间 )。 0086 实施例 5、应用引物对检测染病植物 0087 取自海南的染病植物样本如下：香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜、黄瓜。 0088 一、用引物对甲检测染病植物 0089 1、取染病植物的根结 ( 根瘤 )，提取总 DNA。 0090 2、以总 DNA 为模板进行 PCR 反应，得到 PCR 扩增产物。 0091

35、PCR反应体系(25L) ： 17.1l ddH20 ； 2.5l 10buffer ； 2l dNTP(2.5mM) ； 1l 引物 #C2F3(20M) ； 1l 引物 #1108(20M) ； 0.4l Taq 酶 (5U/l) ； 1l 模板。 0092 PCR 反应程序： 94预变性 4min ； 94变性 1min、 48退火 1min、 72延伸 2min，进行 35 个循环；最后 72保温 5min。 0093 3、 PCR 扩增产物进行 1 ( 含 0.5g/mL EB) 琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE，电压为 80V，电泳约 30min。在凝胶图像

36、系统 (Tanon 4500，天能科技 ( 上海 ) 有限公司 ) 上照像和保存，并用系统的自带软件 ( 天能 GIS 凝胶图像处理系统；版本 4.00，软件注册号： 0003952) 对条带大小进行分析。 0094 结果见图 3。图 3 中： M ：标准分子量； 1 ：香蕉； 2 ：番茄； 3 ：辣椒； 4 ：甜瓜； 5 ：芹菜； 6 ：黄瓜。6 种染病植物均得到约为 1.7kb(1.6kb-1.8kb 之间 ) 的 PCR 扩增产物。说明 6 种植物均为南方根结线虫或爪哇根结线虫侵染。 0095 二、用引物对乙检测染病植物说明书 CN

37、102102100 A CN 102102103 A6/6 页 9 0096 1、取染病植物的根结 ( 根瘤 )，提取总 DNA。 0097 2、以总 DNA 为模板进行 PCR 反应，得到 PCR 扩增产物。 0098 PCR反应体系(25L) ： 17.1l ddH20 ； 2.5l 10buffer ； 2l dNTP(2.5mM) ； 1l 引物 MI-F(20M) ； 1l 引物 MI-R(20M) ； 0.4l Taq 酶 (5U/l) ； 1l 模板。 0099 PCR反应程序： 94预变性4min ； 94变性45S、 58退火45S、 72延伸45S，进行 40

38、个循环；最后 72保温 5min。 0100 3、 PCR 扩增产物进行 1 ( 含 0.5g/mL EB) 琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 0.5TBE，电压为 80V，电泳约 30min。在凝胶图像系统 (Tanon 4500，天能科技 ( 上海 ) 有限公司 ) 上照像和保存，并用系统的自带软件 ( 天能 GIS 凝胶图像处理系统；版本 4.00，软件注册号： 0003952) 对条带大小进行分析。 0101 结果见图 4。图 4 中： M ：标准分子量； 1 ：香蕉； 2 ：番茄； 3 ：辣椒； 4 ：甜瓜； 5 ：芹菜； 6 ：黄瓜

39、。香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜均得到约为 500bp(400b-600b 之间 ) 的 PCR 扩增产物，黄瓜没有得到 PCR 扩增产物。 0102 结合步骤一的结果，得出结论如下：香蕉、番茄、辣椒、甜瓜、芹菜均为南方根结线虫侵染。黄瓜为爪哇根结线虫侵染。说明书 CN 102102100 A CN 102102103 A1/2 页 10 序列表中国热带农业科学院环境与植物保护研究所辅助鉴别根结线虫的方法及其专用引物对 CGGNARY102310 4 1 22 DNA 人工序列 1 ggtcaatgtc agaaatttgt gg 22 2 20 DNA 人工序列 2 tacctttgac caatcacgct 20 3 22 DNA 人工序列序列表 CN 102102100 A CN 102102103 A2/2 页 11 3 gggcaagtaa ggatgctctg ac 22 4 22 DNA 人工序列 4 ctttcatagc cacgtcgcga tc 22 序列表 CN 102102100 A CN 102102103 A1/2 页 12 图 1 图 2 说明书附图 CN 102102100 A CN 102102103 A2/2 页 13 图 3 图 4 说明书附图 CN 102102100 A