植物线虫的分离方法及形态观察

一、目的要求

了解植物线虫的一般形态和植物线虫病害症状特点，了解、掌握常用的分离线虫的方法——漏斗分离法和直接过筛法，明确其分离原理，同时熟悉线虫的生活史。

二、材料和用具

（一）实验材料

1.蔬菜根结线虫病（Melgidogyne incognita）标本及大量根结

2.小麦粒线虫病（Anguina tritici）标本及大量虫瘿

3.水稻干尖线虫病（Aphelenchoides besseyi）标本

4.黄麻根结线虫病（M.incognita）标本

（二）实验用具

显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、小培养皿、放大镜、小剪刀、纱布、带橡皮管的玻璃漏斗、止水夹、小塑料桶、漏斗架、培养皿、小刀、天平、筛子（60、100、200、325网目）、烧杯等。

三、内容和方法

（一）实验原理

线虫是一种低等动物，属于无脊椎动物中线形动物门的线虫纲。 它的种类很多，寄生在植物体上的线虫是其中的少部分。 植物病原线虫能引起多种植物病害，为害根部会引起根瘤、根肿大等畸形，地上部分生长不良；为害茎、叶造成叶扭曲，小叶，黄化，皱缩，干枯等；为害果实、种子常产生虫瘿、肿瘤等畸形症状。 植物寄生线虫的个体很小，除极少数可从植物组织中直接挑出外，绝大多数需借助特定的工具和方法才能分离出。 线虫的分离主要是利用它的趋水性、大小及密度与其他杂质的差异，采用过筛、离心、漂浮等措施，将其从植株组织或土壤中分离出来。

（二）实验方法

1.线虫病害症状观察

观察蔬菜根结线虫病、小麦粒线虫病、水稻秆尖线虫病、黄麻根结线虫病标本，注意根部、茎、叶、种子等的变化。

2.线虫形态的观察

观察蔬菜根结线虫，用解剖针轻轻拨开根瘤病组织，可见组织中有乳白色发亮的小颗粒——根结线虫的雌虫，用解剖针将雌虫挑出放于载玻片上，加1滴蒸馏水，盖上盖玻片，在低倍镜下观察虫体形态。

用解剖针挑取组织中的线虫，置于载玻片上并盖片，最后用橡皮或挑针轻轻压盖玻片，镜检，观察植物线虫的生殖系统及消化系统。

雌虫体为洋梨形，具有一长颈，头部前端为口腔，内有一吻针，后是膨大的基部球，具明显的中食道球。 虫体膨大的部位是腹部，后端为肛门，在腹部常能看到卵巢，卵囊是附在腹部末端的一个囊袋，内有若干卵，卵长圆形、无色，有的卵内可见已开始分化和形成的幼虫。

3.线虫漏斗分离法

该方法操作简单，是目前从植物材料中分离线虫较好的方法。 它利用线虫的趋水性，使游离到水中的线虫沉积在漏斗的底部，从而将其收集。

（1）将玻璃漏斗架在漏斗架上，漏斗下面接10cm橡皮管，橡皮管上装1个止水夹。

（2）将寄主组织洗净后，称20g切碎，用纱布包好，在漏斗中浸泡24h，线虫从寄主组织或土壤中游出，穿过纱布沉落在漏斗底部的橡皮管里。

（3）打开止水夹，把橡皮管里的水收集到培养皿中。

（4）镜检分离到的线虫。

4.线虫过筛分离法

此方法适合分离土壤中的线虫。 利用线虫的趋水性，使线虫悬浮在水中，用筛网将线虫与土壤分开，并从水中分离出线虫。

（1）将土壤充分捣碎，混合均匀。

（2）取其中250g置于小塑料桶中，加水700~1000m L，充分搅动使土壤分散。

（3）沉降10s后，将上面的悬浮液通过60网目的筛子，过滤在第二个小塑料桶中，将60网目筛子上的残余物和第一个小塑料桶桶底的泥沙，用水冲洗弃掉。

（4）将第二个小塑料桶中的液体按顺序依次通过100、200、325网目的网筛，3个筛子上的残余物分别洗在3个容量为250m L的烧杯中。

（5）镜检325目网筛过滤后溶液中的线虫。

（三）注意事项

1.在分离得到的线虫中可能有寄生和腐生的线虫，镜检时要注意区分。

2.若线虫数量太少，可将水样倒入离心管中，在离心机中1500r/min离心3min，倒掉上层清水，将下层沉淀物重悬浮后倒入培养皿中再镜检。

四、实验学时

3学时。

五、作业与思考题

1.每人交可清晰观测玻片1~2片，并完成实验报告1份。

2.寄生线虫和腐生线虫有哪些不同？在镜检时如何区别？

3.试描述根结线虫雌成虫的形态结构特征。

4.如何从寄主植物根组织中分离到根结线虫并观察其卵囊？

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