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嗅觉通路损伤后OMP变化及白藜芦醇对其表达的影响

来源：花匠小妙招时间：2025-01-05 11:40

摘要：目的：探究嗅觉通路损伤后嗅觉标志蛋白(OMP)变化及白藜芦醇对其表达的影响。方法：实验动物随机分为正常对照组(对照组),白藜芦醇给药组(给药组),甲醛蓄积组(甲醛组),甲醛蓄积+白藜芦醇给药组(甲醛+给药组)。对照组不做任何处理；给药组和甲醛+给药组于每日上午8时给予白藜芦醇灌胃治疗，灌胃剂量80 mg/(kg•d),连续灌胃30 d;甲醛组和甲醛+给药组于每日上午9时至12时置于染毒室，共30 d。30 d后行食物埋藏实验、嗅觉躲避实验、嗅觉记忆实验检测其嗅觉功能；处死实验动物后取嗅神经，检测其OMP表达。结果：实验过程中动物无丢失，无死亡；食物埋藏实验结果显示：甲醛组找到埋藏食物时间较对照组长，差异有统计学意义(P<0.05);甲醛+给药组食物埋藏时间较对照组长，较甲醛组时间短，差异有统计学意义(P<0.05)。嗅觉躲避实验结果显示：甲醛组在双蒸水小室所待时间较对照组短，差异有统计学意义(P<0.05);甲醛+给药组双蒸水小室时间较对照组短，较甲醛组时间长，差异有统计学意义(P<0.05)。嗅觉记忆实验结果显示：甲醛组在精油小室所待时间较对照组长，差异有统计学意义(P<0.05);甲醛+给药组双蒸水小室时间较对照组长，较甲醛组时间短，差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹结果显示：甲醛组蛋白含量明显下降，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);甲醛+给药组蛋白含量较对照组降低，较甲醛组相比略有升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：白藜芦醇对嗅觉通路印迹损伤大鼠行为学变化具有明显的促进作用；甲醛蓄积大鼠嗅神经OMP含量降低，白藜芦醇干预后甲醛蓄积大鼠嗅神经OMP蛋白表达呈现上升趋势。

阿尔茨海默病(AD)起病隐匿，又称老年性痴呆，是一种进行性神经退行性疾病[1]。AD患者在学习记忆障碍之前已有嗅觉功能障碍[2-3];功能磁共振成像(fMRI)显示AD病变始发于嗅觉系统外周，进而累积海马等高级脑区。其余神经系统疾病，如帕金森病(PD)、精神分裂症及多发性硬化等疾病亦有类似表现[4-5]。嗅神经(ORNs)由嗅上皮基底细胞持续分化生成，成熟的ORNs中含嗅觉标志蛋白(OMP),OMP在ORNs发生、发育、嗅觉信号传导方面具有重要作用[6]。ORNs树突末端发出纤毛至嗅上皮内，轴突则入颅与嗅球内僧帽细胞/丛状细胞形成突触连接[7]。嗅球内僧帽/丛状细胞轴突将嗅觉信号直接或间接投射至梨状皮层及海马等相关脑区。梨状皮层通过对信息传入与输出调控，参与嗅觉学习、记忆形成[8]。甲醛是具有强氧化效应的有机分子，伴脑组织高耗氧量、高脂含量、低抗氧化特性[9]。相对其他组织器官而言，脑组织对甲醛源性氧化应激更敏感。白藜芦醇属于多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎等效应[10-11]。基于白黎芦醇具有抗氧化、高脂溶性且易通过血脑屏障等特点，能高浓度积聚于脑组织发挥其拮抗气态甲醛所致神经细胞及蛋白质氧化损伤。本实验通过对气态甲醛之嗅觉通路印迹损伤后OMP变化及白藜芦醇对其影响的实验研究，预在疾病隐匿期或早期，通过嗅觉通路对其进行先期干预，防止损害沿嗅觉通路投射播散至高级中枢，达到延缓疾病进展之目的。

1、材料与方法

1.1材料：

试剂：OMP抗体(Abcam公司，ab183947)、β-actin抗体(Abcam公司，ab8226)、蛋白含量检测试剂盒、凝胶配制试剂盒和超灵敏化学发光检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。动物：成年普通级SD大鼠，体重200～250 g, 48只，雌雄各半[湖南省斯莱克景达实验动物有限公司，SCXK(湘)2016-0002],常规饲养。本次研究经湖南医药学院医学伦理委员会审查批准并同意(湖医伦审2021-H093005)。

1.2方法

1.2.1动物分组：

经食物埋藏实验剔除不合格者，适应环境1 w后利用随机数表法将实验动物分为正常对照组(对照组),白藜芦醇给药组(给药组),甲醛蓄积组(甲醛组),甲醛蓄积+白藜芦醇给药组(甲醛+给药组)。每组12只。

1.2.2模型制备：

将浸满甲醛的滤纸放入染毒室，散发出5 mg/m3的恒定浓度，用甲醛浓度监测仪监测，放入大鼠染毒3 h/d,共30 d。染毒期间，确保染毒室密闭，气泵运行良好，动物禁止饮水、进食，并保证染毒室内氧含量在18%～21%左右。对照组不做任何处理；给药组和甲醛+给药组于每日上午8时给予白藜芦醇灌胃治疗，灌胃剂量80 mg/(kg·d),连续灌胃30 d;甲醛组和甲醛+给药组于每日上午9时至12时置于染毒室，共30 d。

1.2.3食物埋藏实验(BFT):

测试前禁食24 h,并于测试前将大鼠放入60 cm×60 cm×40 cm的长方形透明测试箱中适应1 h。测试箱内铺3 cm厚垫料，随机在0.5 cm深处放置一片甜味谷物。将大鼠置于中央，记录从放置大鼠到其找到食物所用时间。

1.2.4嗅觉躲避实验(OAT):

通过记录大鼠对厌恶气味的躲避时间，检测大鼠辨别不同气味的能力[12]。实验装置设计参照黄刚等[13-15]。实验前2 d,每天将实验鼠放入装置中熟悉环境10 min,两个等大小隔内分别放置20μl双蒸水的滤纸。正式实验时，将小隔间内有一处20μl双蒸水的滤纸换成蘸有20μl 2,4,5-三甲基噻唑(nTMT)的滤纸，测试3 min,录制视频，手动测量冻结和回避时间，冻结时间为除呼吸外保持静止超过3 s的时间，回避时间为在未在nTMT气味的滤纸区域中度过的时间，本实验记录回避时间。

1.2.5嗅觉认知记忆实验(ORMT):

ORMT检测大鼠对于气味的识别和记忆能力[16]。测试前3 d,将实验鼠置于干净笼中，并在笼子中放置气味杯10 min,以使实验鼠适应。测试时，让老鼠自由探索气味5 min后，记录实验鼠调查气味所花的时间。对气味的调查被定义为老鼠在气味杯的1 cm范围内且头朝向气味杯[17]。

1.2.6 Western印迹检测OMP表达：

ORNs加入裂解缓冲液后高速冷冻研磨、离心，收集上清，使用BCA试剂盒进行蛋白质定量。制备电泳凝胶，每个样品取40μg上样。利用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后将含有蛋白的PVDF膜分别浸入兔抗OMP单克隆抗体(1∶1 000),4℃过夜，洗膜，加入山羊抗兔IgG(1∶2 000),孵育，TBST洗膜3次，使用ECL试剂盒进行发光，暗室曝光，Image J进行灰度分析，独立实验重复3次。

1.2.7统计学方法：

采用SPSS23.0统计软件进行单因素方差分析。

2、结果

2.1模型制备及一般结果：

实验过程中动物无丢失，无死亡；对照组和给药组动物状态好，饮食饮水正常；甲醛组和甲醛+给药组动物皮毛发黄，甲醛组动物体重下降，动物出现掉毛现象，甲醛+给药组亦出现上述现象，但表现略轻。

2.2行为学结果：

食物埋藏实验结果显示：甲醛组找到埋藏食物时间较对照组长，差异有统计学意义(P<0.05);给药组埋藏时间与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05);甲醛+给药组食物埋藏时间较对照组时间长，较甲醛组时间短，差异有统计学意义(P<0.05)。嗅觉躲避实验结果显示：甲醛组在双蒸水小室所待时间较对照组短，差异有统计学意义(P<0.05);甲醛+给药组双蒸水小室时间较对照组短，较甲醛组长，差异有统计学意义(P<0.05)。嗅觉记忆实验结果显示：甲醛组在精油小室所待时间较对照组长，差异有统计学意义(P<0.05);甲醛+给药组双蒸水小室时间较对照组长，较甲醛组短，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 OMP蛋白表达：

于染毒30 d后处死实验动物，取ORNs,检测其OMP表达。结果显示：甲醛组ORNs蛋白含量明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);对照组与给药组比较差异无统计学意义；甲醛+给药组蛋白含量较对照组降低，较甲醛组相比略有升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1,图1。

表1嗅觉损伤印记行为学检测与OMP蛋白表达

图1各组ORNs中OMP蛋白表达

3、讨论

研究表明，AD患者早期即出现嗅觉损伤的症状，患者的嗅觉鉴定和识别能力均低于正常人[18-19]。fMRI显示AD病变始发于嗅觉系统外周，进而累积海马等高级脑区。

嗅觉功能主要包括嗅觉灵敏度、嗅觉探测和嗅觉识别三个方面[20-21]。食物埋藏实验通过记录大鼠从进入实验区域到找到食物的时间来判断不同组别大鼠嗅觉探测能力，本实验结果显示，大鼠吸入气态甲醛后反应能力减慢，白藜芦醇治疗30 d后可缓解其症状。嗅觉躲避实验通过比较大鼠对2MB和双蒸水两种不同气味的躲避时间，进而来检测大鼠嗅觉识别能力，正常情况下，大鼠会因为讨厌有刺激性气味的2MB而选择待在双蒸水小室，当大鼠嗅觉失常时，将无法区分两种气味[22],本实验结果也证实了这一结论。嗅觉记忆实验通过将食物与气味联系起来，检测大鼠嗅觉的记忆能力，撤掉食物后，大鼠更倾向于停留在原本有食物的隔间，若大鼠嗅觉出现损伤，其学习记忆能力亦会有不同程度的下降。

大鼠主嗅系统由嗅上皮、嗅球、嗅皮层等组成[23-24],嗅神经由嗅上皮基底细胞持续分化生成，成熟嗅神经中含OMP,OMP在ORNs发生、发育、嗅觉信号转导方面具有重要作用。OMP作为嗅觉特异性标记蛋白，其含量变化与嗅觉损伤具有直接关系，本实验结果显示嗅觉损伤后OMP含量下降，给予白藜芦醇治疗后其含量略上升，但与正常组相比仍旧有差别，说明白藜芦醇可以促进损伤的ORNs修复。

参考文献:

[1]郭春杰.基于嗅觉fMRI及多参数DTI的阿尔茨海默病及轻度认知障碍多模态MRI研究[D].长春:吉林大学,2016.

[13]黄刚.Presenilins-1/2双基因敲除对小鼠嗅觉功能的影响及其机制的研究[D].上海:华东师范大学,2013.

基金资助:湖南省大学生创新创业训练计划项目[项目编号:湘教通(2021)197号-4295];大学生创新创业训练计划项目[项目编号:S202312214008;S202312214005];

文章来源:邓佳茜,胡莹,李玉洁,等.嗅觉通路损伤后OMP变化及白藜芦醇对其表达的影响[J].吉林医学,2024,45(11):2612-2615.