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青天葵独脚金内酯合成关键基因D27的克隆与功能分析

来源：花匠小妙招时间：2025-01-05 11:18

【摘要】： 青天葵来源于兰科芋兰属植物毛唇芋兰[Nervilia fordii(Hance)Schltr.]的干燥叶或全草,是岭南道地药材之一。现代化学和药理研究及临床应用效果表明青天葵对呼吸道感染、非典型性肺炎等肺系疾病有显著疗效,药用价值高,需求量大。但是毛唇芋兰种子无胚乳,以无性繁殖为主,每株每年只长1-2个块茎,且每个块茎只长一片叶子,加上其对生长环境要求极高,野生资源分布零星,分布面积逐年减少,造成野生资源短缺。植物株型是与作物产量直接相关的生物性状,而植物分枝是影响植物株型的重要因素之一。独脚金内酯(SLs)是近年来发现的一种具有控制植物分枝功能的新型激素,能与生长素、脱落酸相互作用进而调控植物的生长发育、控制侧芽的生长。本研究拟从植物生长发育调节的角度,基于对已有的青天葵转录组数据中独脚金内酯通路相关基因的挖掘,克隆独脚金内酯合成关键基因NfD27,利用同源重组技术构建植物表达载体和蛋白表达载体,对NfD27进行亚细胞定位分析、转基因拟南芥表型观察和体内外酶活性分析,探讨NfD27对青天葵侧枝发育的影响,为了解青天葵中独脚金内酯调控株型的机制提供基础。本论文主要研究内容和结果包括:(1)利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得3条NfD27基因,分别命名为NfD27aL、NfD27aS、NfD27b。NfD27aL基因全长 1074 bp,ORF 为 765 bp;NfD27aS基因全长834 bp,ORF为642 bp;NfD27b基因全长1160 bp,ORF为774 bp。生物信息学分析结果表明,NfD27aL、NfD27aS和NfD27b均含有属于DUF4033超基因家族的保守功能域,主要定位于叶绿体,属于非分泌蛋白。进化树分析结果表明,NfD27aL和NfD27aS聚为一个分支,与番茄、烟草、拟南芥等双子叶植物亲缘性较高,而NfD27b与MtD27聚为一个分支,与大麦、甘蔗等单子叶植物亲缘性较高。(2)利用同源重组技术构建获得蛋白表达载体pMAL-NfD27aL、pMAL-NfD2 7aS、pMAL-NfD27b,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)后,获得其表达菌株。经过诱导表达、纯化后,得到目的蛋白MBP-NfD27aL、MBP-NfD27aS、MBP-NfD27b。将获得的目的蛋白与底物all-trans-β-carotene进行酶促反应,HPLC检测结果表明,NfD27aL、NfD27aS和NfD27b蛋白具有体外酶活性功能,能将all-trans-β-carotene异构为9-cis-β-carotene和13-cis-β-carotene。另外,将蛋白表达载体分别与能自身合成all-trans-β-carotene的pAC-BETA 载体共同转化大肠杆菌 BL21(DE3)后,获得 BETA-NfD27aL/BL21(DE3)、BETA-NfD27aaS/BL2 1(DE3)、BETA-NfD27b/BL21(DE3)表达菌株。将其进行诱导培养后,在第6、18、24、30、42、48 h收集菌体,用丙酮提取色素,HPLC检测结果表明,NfD27aL、NfD27aS和NfD27b蛋白具有体内酶活性功能,能将all-trans-β-carotene异构为 9-cis-β-carotene、13-cis-β-carotene 和 15-cis-β-carotene。其中,NfD27aL 的主要异构产物为 9-cis-β-carotene,而 NfD27aS 和 NfD27b 的主要异构产物为 13-cis-β-carotene。(3)同样利用同源重组技术构建获得植物表达载体35S::NfD27aL-EGFP、35S::NfD27aS-EGFP、35S::NfD27b-EGFP,转化农杆菌EHA105后,利用注射法进行瞬时表达,观察烟草叶片原生质体发现,NfD27aL、NfD27aS和NfD27b定位于叶绿体,发出绿色荧光。利用浸花法转染d27突变体拟南芥,收集得到T0代种子。通过MS+Kan培养基进行转基因苗的筛选,已获得T1代转基因植物,表型观察和功能分析有待进一步研究。

【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019