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一种利用抑菌培养基培育生菜的组培方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2024-12-31 20:02

本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种利用抑菌培养基培育生菜的组培方法，属生物
技术领域：
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背景技术：
：生菜(LactucasativaL.)，又称叶用莴苣，是菊科莴苣属莴苣种中的一个变种，为一年生或二年生草本作物。因其生长快、易栽培、产量高、鲜食口感好，同时它不仅含有抗氧化物、β胡萝卜素、维生素B、维生素C和维生素E，还含有丰富的微量元素和膳食纤维素，具有一定的药用价值，故而颇受人们的青睐。生菜常规育种杂种优势不明显，并且杂交技术难度大，从而造成杂交种子价格偏高，限制了生产的发展。通过组织培养技术进行扩繁，既可以保持优良品系的种性，又具有周期短、成本低、繁殖系数高等优点。另外，在植物基因工程研究中，有关生菜的遗传转化研究开展较早，是一种用于表达外源蛋白的良好宿主植物，已成为很好的生产食用疫苗生物反应器，而基因工程技术的应用前提是建立高效的组织培养体系。因此，无论是生菜无性繁殖，还是基因工程研究，均需要对其进行组织培养。生菜组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗材和人工成本。常规的生菜组织培养方法要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。如果能通过抑菌的方法来改造培养基，使培养基在不需要进行高温高压灭菌，就能够获得生菜的正常生长。这样，一方面可以降低生菜组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，缩减了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展生菜组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对生菜生长产生毒害或抑制，即不影响生菜的正常生长，从根本上简化了生菜组织培养。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用抑菌培养基培育生菜的组培方法。本发明的目的是通过以下方法实现的。本发明的一种利用抑菌培养基培育生菜的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、愈伤组织增殖、分化培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为：MS+0.5～1.5mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L乳酸链球菌素+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；愈伤组织增殖培养基为：MS+0.2～1.0mg/L2,4-D+0.2～1.0mg/LBA+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L乳酸链球菌素+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+0.2～0.5mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L乳酸链球菌素+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.1～1mg/LIAA+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L乳酸链球菌素+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；所述6-BA，指6-苄氨基嘌呤；所述NAA，指α-萘乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固，备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：选取田间无病虫害生长旺盛的生菜嫩茎，用清水冲洗30min，然后用体积比为75％酒精消毒30s，再用重量体积比为0.05％的升汞消毒2min，无菌水冲洗不少于4次，消毒后的材料在超净工作台上去皮，切成0.2～0.4cm的小块，接种于诱导培养基上，培养30d后能诱导生长出愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.愈伤组织增殖：将诱导出的愈伤组织转接到愈伤组织增殖培养基中，每30d转接一次，大量增殖；培养室温度为26℃，暗培养；6.分化培养：将愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步诱导出小芽，小芽逐步发育成不具根的幼苗；培养室温度为26℃，光照16h，光照强度为2000Lx；7.生根培养：取高度为2～3cm芽苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照16h，光照强度为3000Lx；8.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡20min后，移栽至透水性好的土壤中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。本发明的应用效果：本发明的抑菌组培方法，利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用，配制的培养基是无需高温高压灭菌。因此，在生菜诱导培养、增殖培养、生根培养各个阶段，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。1.诱导培养：通过实验证实，本发明的一种利用抑菌培养基培育生菜的组培方法与常规的生菜组培方法相比，结果如表1所示，在诱导培养阶段，外植体诱导率差异不明显。表1本发明的抑菌组培方法对生菜诱导培养的影响组培方式外植体数外植体污染数诱导率(％)常规组培方法852570.6抑菌组培方法882373.92.愈伤组织增殖培养：本发明的抑菌组培方法与常规组培生菜的增殖倍数和污染率的比较，结果如表2所示，增殖倍数和污染率两个指标都差异不显著。表2本发明的抑菌组培方法对生菜增殖倍数和污染率的影响组培方式增殖倍数平均污染率(％)常规组培方法7.50.30抑菌组培方法7.60.263.分化培养：在分化培养过程中，本发明的抑菌组培方法与常规的生菜组培方法相比，由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，分化率差异不显著，但组培苗生长效果更好，结果如表3所示。表3本发明的抑菌组培方法对生菜愈伤组织分化率和污染率的影响组培方式平均分化率(％)平均污染率(％)常规组培方法870.35抑菌组培方法890.324.本发明的抑菌组培方法对生菜生根率和污染率的影响：在组培苗生根过程中，本发明的抑菌组培方法与常规的生菜组培方法相比，由于本发明的抑菌组培方法的培养基不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，生菜组培苗生根效果更好，结果如表4所示，生根率和污染率的差异不显著。表4本发明的抑菌组培方法的生菜瓶苗生根情况组培方式生根率(％)平均污染率(％)常规组培方法910.63抑菌组培方法930.565.成本分析：本发明的抑菌组培方法与常规组培的成本分析见表4。本发明组培省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从直接费用计算，每年可以节约5.5万元左右(以每天配制50L培养基计算)，另外，常规组培还需要添置高压锅等设备及日常维护，以及存在实验室安全等问题。表4本发明的生菜抑菌组培方法与常规组培的成本分析表本发明具有如下有益效果：1.本发明的生菜抑菌组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了生菜组培技术环节，降低了生菜组培成本。2.本发明的生菜抑菌组培方法，操作简单，只需按不同的培养基配方配制后即可，实用性强，推广性好。3.本发明的生菜抑菌组培方法与常规的生菜组培方法对比，可以降低成本10％以上。具体实施方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。实施例一：一种利用抑菌培养基培育生菜的组培方法一种利用抑菌培养基培育生菜的组培方法，包括以下步骤：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为：MS+1.0mg/L2,4-D+60mg/L次氯酸钠+3mg/L乳酸链球菌素+30mg/L特美汀+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；愈伤组织增殖培养基为：MS+0.6mg/L2,4-D+0.5mg/LBA+60mg/L次氯酸钠+3mg/L乳酸链球菌素+30mg/L特美汀+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+0.3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+60mg/L次氯酸钠+3mg/L乳酸链球菌素+30mg/L特美汀+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.5mg/LIAA+60mg/L次氯酸钠+3mg/L乳酸链球菌素+30mg/L特美汀+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：选取田间无病虫害生长旺盛的生菜品种罗马生菜嫩茎，用清水冲洗30min，然后用体积比为75％酒精消毒30s，再用重量体积比为0.05％的升汞消毒2min，无菌水冲洗4次，消毒后的材料在超净工作台上去皮，切成0.2～0.4cm的小块，接种于诱导培养基上，培养30d后能诱导生长出愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.愈伤组织增殖：将诱导出的愈伤组织转接到愈伤组织增殖培养基中，每30d转接一次，大量增殖；培养室温度为26℃，暗培养；6.分化培养：将愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步诱导出小芽，小芽逐步发育成不具根的幼苗；培养室温度为26℃，光照16h，光照强度为2000Lx；7.生根培养：取高度为2～3cm芽苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照16h，光照强度为3000Lx；8.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡20min后，移栽至透水性好的土壤中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。当前第1页1 2 3