【New Phytol】R2R3 MYB型激活剂和阻遏剂之间的相互作用调节香蕉中的原花青素的生物合成

文章信息

题目：Interplay between R2R3 MYB-type activators and repressors regulates proanthocyanidin biosynthesis in banana (Musa acuminata)

刊名：New Phytologist

作者：Ruchika Rajput，Ashutosh Pandey et al.

单位：National Institute of Plant Genome Research, India

日期：16 July 2022‍

摘要

1

原花青素是一种低聚黄酮类化合物，可促进植物抗病性并有益于人类健康。香蕉是世界上种植最广泛的作物之一，其果肉中含有原花青素。然而，微调香蕉中原花青素生物合成的转录调控网络仍然知之甚少。

我们对两种原花青素特异性 R2R3 MYB 激活剂 (MaMYBPA1-MaMYBPA2) 和四种阻遏物 (MaMYBPR1-MaMYBPR4) 进行了表征，以阐明香蕉中原花青素生物合成的转录调控机制。

MaMYBPA1和MaMYBPA2的异源表达部分补充了拟南芥原花青素缺乏的透明 testa2突变体。MaMYBPA1 和 MaMYBPA2 与 MaMYCs 物理相互作用以在体外反式激活花青素合成酶、无色花青素还原酶和花青素还原酶基因，并与 MaTTG1形成功能性 MYB-bHLH-WD 重复 (MBW) 复合物以在体内反式激活这些启动子。

MaMYBPA s 单独或与MaMYC在香蕉果实中的过表达诱导原花青素积累和原花青素生物合成相关基因的转录。MaMYBPR 阻遏物也显示出与 MaMYCs 相互作用，形成阻遏 MBW 复合物，并减少原花青素积累。有趣的是，MaMYBPA 的过表达诱导了 MaMYBPR 的表达，表明通过形成竞争性 MBW 复合物对原花青素生物合成的灵活调节。我们的研究结果揭示了 R2R3 MYB- 的调节模块，可以微调原花青素的生物合成，并为基因操作提供可能的目标，以改善香蕉的营养。

技术路线

2

Dessert banana, Musa acuminata (AAA genome) cultivar 'Grand Nain’

Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis

In silico gene expression analysis

Gene expression analysis

Cloning of transcriptional regulators

Subcellular localization of transcriptional regulators

Ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC) and Liquid chromatography–
mass spectrometry (LC-MS)

Yeast two hybrid assay

Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay

Complementation analysis in Arabidopsis

DMACA staining of seeds and determination of proanthocyanidin contents

Structural analysis of the MaANR, MaANS, and MaLAR promoters

Yeast one-hybrid (Y1H) assay

Transient overexpression in immature banana fruit slices

主要结果

3

3.1 尖锐湿疣病菌原花青素激活R2R3-MYB调节因子的鉴定

在此，我们重点研究了两种与已知原花青素调节剂高度相似的同源R2R3 MYB激活剂（Ma03_p07840和Ma10_p17650），并将其命名为MaMYBPA1（Ma03_g07840）和MaMYBP A2（Ma10_g17650）。PA代表原花青霉素激活剂。以前的报告表明，除了激活剂外，阻遏物也作用于类黄酮通路。我们确定了四个候选的R2R3 MYB原花青素阻遏物（PR），分别命名为MaMYBPR1、MaMYBPR2、MaMYPPR3和MaMYBP R4，它们的C末端都具有保守的C1（lsrGIDPxT/NHR）、C2（pdLNLD/EL）和TLLLFR阻遏基序（图S1a）。

我们探索了MaMYBPA和MaMYBP蛋白与已知的单子叶和双子叶植物R2R3 MYB激活剂和阻遏剂的系统发育关系。这四个MaMYBPR与之前已知的原花青素特异性阻遏物形成一个分支，表明其作为类黄酮特异性阻滞剂发挥作用（图1a）。类似地，MaMYBPA1和MaMYBP A2与已知的R2R3 MYB激活剂（如拟南芥TT2、草莓FaMYB9、苹果MdMYB8）以及葡萄等水果作物的同源物形成了一个分支（图1a）。MaMYBPA1和MaMYBP A2与来自拟南芥（AtTT2）、野生苹果（Malus sieversii；MdMYB9、MdMYP11和MdMYB12）、草莓（FaMYB8）和葡萄（VvMYBPA2）的先前特征化原花青素调节器的多重序列比对表明，它们的N末端R2R3 MYB结构域和bHLH共有基序[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R之间高度保守，而C末端区域含有SG5基序（IRTKA[I/L]RC）对R2R3 MYB具有特异性，可积极调节原花青素生物合成（图1b）。

我们通过短暂共渗构建物来确定MaMYBPA1和MaMYBP A2的亚细胞定位，该构建物编码烟草本哈米纳表皮细胞中的黄色荧光蛋白（YFP）融合和核标记物NLS-RFP（红色荧光蛋白[RFP]融合到核定位信号[NLS]）。我们仅在严格共定位的NLS-RFP细胞核中检测到YFP荧光（图1c），表明MaMYBPA1和MaMYBP A2是核蛋白。我们在MaMYBPR中获得了类似的结果，与它们作为转录抑制因子的预测功能一致（图S1b）。

Fig. 1

3.2 MaMYBPA表达模式与其结构靶基因和代谢物含量相关

我们使用转录组深度测序（RNA-Seq）数据集，包括代表不同器官和发育阶段的香蕉样本：胚胎细胞悬浮（EC）、幼苗芽（SS）、幼苗根（SR）、根（R）、幼（YL）、成体（AL）和老叶（OL）阶段、果肉阶段S1-S4和果皮阶段S1–S4，以分析MaMYBPA1和MaMYBP A2基因以及三个原花青素生物合成基因MaANS、MaLAR和MaANR的表达。

MaMYBPA1和MaMYBP A2在果肉早期（S1）高度表达（图2a）。MaANS和MaANR在胚胎发育的S1阶段也高度表达（图2a）。我们还使用超高效液相色谱法（UHPLC）和液相色谱-质谱法（LC-MS）进行了目标代谢物分析，以量化不同器官中的三种单体和四种低聚原花青素形式（图2b、2c；图S2a和S2b）。

这表明，香蕉果实的幼叶、苞片和果皮中富含单体和低聚物形式（图2c）。与上述表达数据相反，我们没有观察到基因表达谱与代谢物含量之间的正相关。

3.3 MaMYBPA1和MaMYBP A2与MaMYC相互作用

由于原花青素生物合成依赖于调节性MBW复合体，我们试图鉴定伙伴bHLH和WD40蛋白。系统发育分析显示，香蕉参考基因组编码了五种GLABRA3（EGL3）样增强蛋白和八种TT8样bHLH蛋白。我们根据染色体位置将bHLH蛋白命名为MaMYC1至MaMYC13（图S3）。

我们还对MaTTG1进行了系统发育分析，得到了两个类似TTG1的蛋白，分别命名为MaTTG1.1和MaTTG1.2（图S3）。由于MaMYBPA1和MaMYBP A2都含有bHLH结合基序（[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R），我们测试了它们是否能够与MaMYC相互作用。我们确定，在酵母双杂交（Y2H）分析中，MaMYBPA1与MaMYC2和MaMYC7相互作用，而MaMYBP A2仅与MaMYC9相互作用（图3a），支持两个R2R3 MYB和MaMYC蛋白质之间的直接相互作用。

此外，在添加X-α-gal的选择性培养基上出现蓝色，表明MaMYB和MaMYC蛋白之间存在强烈的物理相互作用。在此，组合MaMYBPA1/MaMYC3、MaMYBP A1/MaM YC9、MaMYPPA1/MaMYC13、MaMYBPA2/MaMYC2、MaMYSBPA2/MaMYC3和MaMYPPA 2/MaMYC7未显示交互作用（图S4）。

我们还对本氏烟叶片进行了双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCI）分析，以在植物上推广这些结果。事实上，当编码MaMYBPA1 YFPN和MaMYC2 YFPC、MaMYBP A1 YFPN和MaMYC7 YFPC的结构体暂时共同渗透到叶片中时，我们在BiFC分析中检测到了YFP的重组，表明了蛋白质-蛋白质相互作用（图3b）。我们通过LCI分析获得了可比较的结果，证明了MaMYBPA1和MaMYC2、MaMYC7之间以及MaMYBP A2和MaMYC9之间的相互作用（图3c）。我们还测试了MaMYC2和MaMYC9的定位，发现MaMYB-MaMYC均位于细胞核内（图S5）。

Fig. 3

3.4 MaMYBPA1和MaMYBP A2部分恢复拟南芥tt2-1突变体的原花青素缺乏表型

我们在拟南芥tt2-1突变体中过度表达MaMYBPA1和MaMYBP A2，该突变体在原花青素调节基因R2R3 MYB tt2中有缺陷，种子呈黄色，而不是正常的棕色种子。我们用二甲氨基肉桂醛（DMACA）对几个含有35Spro:MaMYBPA1或35Spro:MaMYBP A2转基因的稳定转基因系的种子进行染色，染色种子的蓝黑色证明了原花青素积累的恢复（图4a）。此外，分光光度定量分析表明，携带35Spro:MaMYBPA1转基因的转基因系L-1、L-7和L-8以及携带35Spro：MaMYBP A2的系L-4、L-10和L-13在其种子中积累原花青素，而tt2-1（透明种皮2-1）突变种子缺乏可检测到的原花青素。值得注意的是，没有转基因系将原花青素含量恢复到野生型水平（图4b）。所以，我们得出结论，MaMYBPA1和MaMYBP A2可能是香蕉中的原花青素调节剂。

Fig. 4

3.5 MaMYBPA与MaANS、MaANR和MaLAR启动子结合

为了将TFs与其靶点联系起来，我们在结构原花青素生物合成基因的启动子中寻找推测的MYB结合位点（MBS）和bHLH结合位点（BBS）。在我们对MaANS（1904）、MaANR（2000）和MaLAR（1734）启动子的初步结构分析中，我们寻找了可能存在的MYB-（MBS）和bHLH结合位点（BBS）。我们在1234 bp MaANS启动子片段（转录起始位点上游的proMaANS-1234）内鉴定了五个推测的MBS和六个BBS。同样，我们在MaLAR-1518启动子中检测到五个MBS和六个BBS位点（MaLAN上游的1518 bp片段），而MaANR-1516启动子包含六个MBS位点和五个BBS部位（MaANR上游的1516 bp片段）。就数量和距离而言，我们在三个启动子的选定区域发现了推定结合位点的积累，并决定使用给定的启动子片段进行进一步分析。推定结合位点的详细信息如图5a所示。

然后，我们进行了酵母单杂交（Y1H）分析，结果表明MaMYBPA1和MaMYBP A2与proMaANS-756、proMaLAR-839和proMaANR-938结合，而相应的空载体对照没有。这些结果表明，MaANS、MaANR和MaLAR可能是MaMYBPA1和MaMYBP A2的靶基因（图5b）。

Fig. 5

3.6 含有MaMYBPA的MBW复合物激活MaANS、MaANR和MaLAR启动子

为了评估MaMYBPA1和MaMYBP A2在植物体内对其靶基因proMaANS-1234、proMaANR-1516和proMaLAR-1518启动子的反式激活潜力，我们瞬时转染拟南芥原生质体进行反式激活分析。为此，我们将β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因置于每个启动子的控制下，并将报告基因与代表一个或多个TF的效应体结构共转染。每个MaMYBPA单独在一定程度上激活了MaANS、MaANR和MaLAR启动子。然而，MaMYBPA1或MaMYBP A2与MaMYC或MaMYC和MaTTG1的共转染进一步诱导了受试启动子的反式激活（图5c）。这些结果表明，MaMYBPA1和MaMYBP A2在植物体内与MaMYC和MaTTG1形成功能性MBW复合物，并反式激活原花青素生物合成基因MaANS、MaLAR和MaANR的启动子。MaTTG1与来自两个单子叶物种comosus和urartu的直系同源基因紧密聚集（图S6）

3.7 含有MBW复合物的MaMYBPR与MaANS、MaANR和MaLAR启动子结合并抑制其转录激活

为了测试假定阻遏物对目标基因启动子proMaANS-1234、proMaLAR-1518和proMaANR-1516反式激活的影响，我们对本氏烟叶片进行了双重荧光素酶分析。我们将萤火虫荧光素酶（LUC）报告基因置于每个启动子片段的控制下，并用一个或多个效应器结构瞬时渗透每个报告结构（图6a）。与拟南芥原生质体中的反式激活分析一致，我们观察到当MaMYBPA1或MaMYBP A2过度表达时，与没有任何效应器（效应器-）的启动子结构相比，发光强度显著增加，这表明这两种TF自身都与proMaANS、proMaLAR或proMaANR结合（图6b）。然而，MaMYBPA1或MaMYBP A2与MaMYCs的共渗使受试启动子的反式激活水平高于单独与MaMYPPA或MaMYPPA2的共渗。重要的是，MaMYBPA1或MaMYBP A2与MaMYC的共过滤以及假定的MaMYB阻遏物MaMYBPR2、MaMYBBR3或MaMYPPR4抑制的启动子转录激活的效应器结构，如测量的较低相对LUC活性所示（图6b）。这些结果表明，MaMYBPR在MBW复合体中起阻遏作用。

Fig. 6

3.8 MaMYBPAs瞬时过表达增强未成熟香蕉果实中原花青素的积累

接下来，我们在未熟香蕉切片中分别或连同其相互作用的bHLH伙伴（MaMYBPA1+MaMYC2和MaMYBP A2+MaMYC9）短暂过度表达MaMYBPA1和MaMYPPA 2。每个TF由玉米泛素1（ZmUBI1）启动子驱动，而GUS报告子由菜豆的UBI1启动子驱动作为瞬态转化的对照（图7a）。我们观察到果片成功转化，如GUS活性所示（图7b）。DMACA染色显示转化的水果切片中有原花青素的积累。虽然我们在未转化对照中检测到少量的原花青素积累，但在仅用MaMYBPA转化的水果切片中，以及在与MaMYBP A和MaMYC共转化的水果片中，原花青素的量显著增加（图7c）。

我们还用分光光度法对转化水果切片中的原花青素进行了定量，这证实了水果切片中色素的积累，这些色素单独或与MYC伙伴联合短暂过度表达每个MYB（图7d）。MaMYPPA1或MaMYBPA2的过度表达单独导致原花青素含量相当（图7c），这表明MaMYPBA1和MaMYPPA 2的表达为香蕉果肉中原花青霉素的生物合成提供了充足的通量。此外，MaMYBPA1和MaMYC2或MaMYBP A2和MaMY C9的联合过表达进一步增强了原花青素的生物合成，并在MaMYBA和MaMYC2中积累了最高的原花青素酶。

RT-qPCR分析表明，目标结构基因的表达水平与原花青霉素谱呈强正相关。事实上，与只表达MaMYBPA1或MaMYBP A2的水果相比，瞬时共表达MaMYPPA1+MaMYC2的水果中相对的MaANS、MaLAR和MaANR转录水平被诱导到更高的水平。值得注意的是，MaMYPPA 2和MaMYC9的共表达导致转录水平与仅表达MaMybPA 2的水果相似（图7e）。

Fig. 7

3.9 在MaMYBPA过度表达的香蕉水果片中诱导R2R3 MYBPR

为了分析MaMYBPA和MaMYC对阻遏物型R2R3 MYB基因转录水平的影响，我们对单独或结合MaMYB（MaMYB+MaMYC）短暂过度表达MYB的香蕉果片进行了RT-qPCR。有趣的是，MaMYBPA的过度表达或MaMYBs和MaMYCs不同组合的共同表达会对MaMYBP的表达产生不同的影响（图7f），这表明这些阻遏物通过形成负反馈环来防止原花青素过度积累。

Fig. 7

3.10 MaMYBPR与MBW复合体中的不同调节器相互作用

上述结果支持MaMYBPA和bHLH蛋白之间的物理相互作用形成MBW复合物。由于所有MaMYBPR在其N末端也携带bHLH基序，我们通过酵母双杂交（Y2H）和BiFC分析测试了MaMYBP及其假定的bHLH伙伴之间的相互作用。在Y2H中，MaMYBPR1与MaMYC7和MaMYC相互作用，而MaMYBP R2、MaMYBBR3和MaMYPPR4与MaMYC2、MaMYC7和MaRYC9相互作用（图8a）。我们检测到MaMYBPR1和MaMYC7之间以及MaMYBP R3和MaMYC2之间存在更强的相互作用，这可以通过在含有X-Gal的选择性培养基上出现蓝色菌落来证明，与菌落保持白色的其他组合相比（图8a）。

我们通过本氏烟叶片的原位BiFC分析确认了Y2H结果（图8b）。我们未能检测到MaMYBPR1和MaMYC9、MaMYBP R2和MaMYC2-MaMYC 7组合，或MaMYBBR3和MaMY C7-MaMYC3组合的原位相互作用，尽管我们观察到Y2H中的相互作用，这可能反映了酵母和植物核之间的不同环境。

这些结果表明，MaMYB阻遏物可能通过与MabHLH辅因子相互作用抑制MBW复合体的活性。我们还分析了这些相互作用组合是否共定位，发现MaMYBPR和MaMYC都共定位于细胞核（图8c）。

Fig. 8

3.11 MaMYBPR通过抑制原花青素生物合成基因防止香蕉中原花青素积累

我们使用瞬时表达分析法确定了未成熟香蕉果实中MaMYBPR的功能。因此，我们使用ZmUBI1启动子单独或与相应的MaMYC结合过度表达MaMYBPR1–MaMYBP R4。转化果实显示GUS活性，表明转化成功（图9a）。

原花青素的分光光度定量表明，与未转化（对照）的水果切片相比，单独或与MaMYC伙伴联合短暂过度表达MaMYBPR1、MaMYBP R2、MaMY BPR3或MaMY BP R4的水果积累较少的原花青霉素（图9b）。

MaMYBPR3、MaMYBPR4和MaMYBP R1+MaMYC7、MaMYPPR3+MaMYC2转化果实中激活基因MaMYBBA1和MaMYPPA2以及生物合成基因MaANS、MaLAR和MaANR的相对转录水平远低于对照果实切片（图9c和d）。相比之下，与对照水果切片相比，单独或联合过度表达MaMYBPR1或MaMYBP R2或MaMY BPR2的水果，或同时过度表达MaM YBPR2和MaMYC9，或MaM YBP R4和MaMY C9的水果，显示相同基因的表达水平增加（图9c和d）。我们假设激活基因MaMYBPA1和MaMYBP A2可能在过度表达MaMYBBR1、MaMYBPR2、MaMYPPR2和MaMYC9，或MaMYBTR4和MaMYS9的水果中高水平表达，导致整体抑制活性降低。

Fig. 9

3.12 MaMYPPR与MaMYBPA蛋白物理相互作用

我们通过BiFC分析在本氏烟叶片中测试了MaMYBPRs和MaMYBP As之间相互作用的潜力。我们确定MaMYBPA1和MaMYBPA2分别与MaMYBP R3和MaMY BPR1表现出TT8独立的相互作用，而MaMYBBA1和MaM YBPA2均未与MYBPR2或MYBPR4相互作用（图S7）。这些结果表明，PR类MYB TF与MaMYBPA在物理上相互作用，而无需bHLH伴随因子将其并入MBW复合体。

结论

4

根据我们的研究结果，我们提出了一个模型，该模型说明了激活剂和阻遏剂之间的相互作用，以及激活剂如何诱导阻遏物的表达，阻遏物质随后通过泛素降解而减少，从而增强香蕉中原花青素的生物合成（图10）。

这项研究提高了我们对单子叶植物中原花青素生物合成分子基础的认识，其中原花青素酶的调控研究不如双子叶植物，并为基因组编辑提供了涉及原花青霉素生物合成的靶点，以进一步指导香蕉生物发育中花青素的含量。由于香蕉水果是生吃的，它们将成为不耐热花青素生物强化的理想载体。

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5

原文链接：

https://nph.onlinelibrary./doi/10.1111/nph.18382

PDF获取：

https://www./h-nd-111.html#_np=107_423

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