一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米

本发明涉及生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及神经肽npf1a基因的dsrna及其在防治梨小食心虫中的应用。

背景技术：

梨小食心虫是一种世界性广泛的蛀果害虫。其幼虫喜欢钻蛀和取食一些蔷薇科植物的果实，比如桃、梨、苹果等，这造成果园大面积果实脱落和质量下降及巨大的经济损失。因此有效防控梨小食心虫幼虫的爆发具有重要的研究意义。

梨小食心虫的初孵幼虫是最开始钻蛀取食果实的为害对象，这个为害阶段是实际控制梨小食心虫大爆发的关键时期，因此开展梨小食心虫幼虫取食行为的神经调控研究，既能有助于研发防控梨小食心虫幼虫的潜在靶标分子的rna制剂，又能对果园害虫的防治有着十分重要的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米-rna制剂。为实现上述目的，本发明首次公开了一种梨小食心虫神经肽npf1a基因的dsrna，所述dsrna在与纳米颗粒结合后，经透皮作用进入到昆虫体内，起到抑制npf1a基因表达的作用，进而抑制梨小食心虫的生长发育及取食行为。

本发明的第一方面公开一种dsrna，本发明提供的npf1a基因的dsrna的核苷酸序列：

gaacaagaacttcgccatcgctgtagccgttgtgctggcttgcgtgtgcctcgccgaggcgcgcgaggagagtccgcacgacatgtcggaggcgcttcgcatgcttcaggagttggatcgctactacactcaggctgctagacccaggttcggcaaacgctctgatgccttcacaaactgggctaaggatctc，如seqidno.5所示。

本发明提供的npf1a基因的dsrna由seqidno.1和seqidno.2所示引物扩增得到，本发明得到的dsrna以神经肽npf1a为靶标分子，结合纳米载体构建透皮双链rna传递系统，通过室内行为学技术研究证明神经肽npf1a的纳米-rna制剂对幼虫取食行为的调控作用。

本发明第二方面提供使用上述dsrna制备得到的生物材料，如表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

本发明的第三方面公开一种防治梨小食心虫的产品，其活性成分为上述的dsrna或上述dsrna制备得到的生物材料。

这种防治梨小食心虫产品的配方含有纳米颗粒和/或表面活性剂；优选所防治的梨小食心虫为四龄幼虫或初孵幼虫。

通过对配方进一步筛选，发现神经肽npf1a的纳米-rna配方为1-5μg/μl纳米载体(nanocarriers)、1-5μg/μldsnpf1a、10-3-10-4表面活性剂(detergent)对初孵幼虫生存率和蛀果率均有抑制效果。

在使用dsrna进行昆虫防治时，多采用透皮法或饲喂法导入昆虫体内，均没有提供可在田间应用纳米-rna制剂的实施方式。

本发明的第四方面提供一种防治梨小食心虫的方法，采用喷雾法喷施含有抑制梨小食心虫神经肽npf1a基因表达的物质。可进一步推广神经肽npf1a的纳米-rna制剂在田间的应用，如：为治理果园中的梨小食心虫，在果园的土壤、树木、果实表面喷施含有抑制梨小食心虫神经肽npf1a基因表达的物质。

将dsnpf1a应用到梨小食心虫的田间防治时，首先需要解决dsrna的大量合成的问题。在本发明提供的喷雾法防治梨小食心虫的方法中，通过构建npf1a-pet30-bl21(de3)rnaseiii-系统，大量合成dsnpf1a。

具体地，本发明提供的喷雾法防治梨小食心虫的方法包括：

设计npf1a的左右片段的上下游引物(如seqidno.6-9所示)，用ecorⅰ-xbai酶消化186bppcr产物生成npf1a-l，用xbaⅰ-xhoⅰ酶消化213bppcr产物生成npf1a-r。npf1a-r末端有一个27bpdna序列形成茎环结构。

npf1a-l和npf1a-r的片段克隆到pet-30a载体上，生成重组pet30-npf1a表达载体。重组表达载体pet30-npf1a转入bl21(de3)rnaseiii表达感受态细胞中。经单克隆摇菌、摇床培养、菌液80℃孵育、离心、乙醇溶解菌株后，8000转下离心10min，150mmnacl悬浮离心所得沉淀、再次离心，所得上清液为粗提取的dsrna，纯化后得dsnpf1a如seqidno.10所示，其与seqidno.5仅有少数碱基的差异。

在本发明中，优选梨小食心虫为四龄幼虫或初孵幼虫。

根据本领域技术人员的理解，seqidno.5所示的dsrna或由seqidno.1和seqidno.2所示引物扩增得到的dsrna，以及由该dsrna制备得到的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在抑制梨小食心虫中npf1a基因表达、减少梨小食心虫蛀果率、减少梨小食心虫的取食量、增加梨小食心虫死亡率、制备果树农药、制备拮抗梨小食心虫的药物的应用，也是本发明保护的范围。

本发明的有益效果在于：

(1)本研究表明神经肽npf1a的纳米-rna制剂能抑制梨小食心虫幼虫的取食行为，减少初孵幼虫蛀果率和存活率。

(2)基于己有的研究表明靶标分子的dsrna能在大肠杆菌中大批量生产，并且基于纳米载体的dsrna可以以喷洒的方式进行田间害虫的防治。

(3)本发明得到的神经肽npf1a的纳米-rna制剂可以作为潜在的生物药剂用来防治果园害虫，且对田间害虫的防治有着重大应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中神经肽npf1a的纳米-rna制剂对四龄幼虫取食行为的影响；其中(a)是纳米载体,dsrna和助剂三者的配方示意图；(b)是纳米-rna制剂处理48h后四龄幼虫的取食量检测结果图；(c)是纳米-rna制剂处理48h后四龄幼虫取食选择测试结果图；(d)是四龄幼虫在处理纳米-rna制剂后24h、48h和72h处的蛀果率结果图。

图2为本发明实施例3中神经肽npf1a的纳米-rna制剂对初孵幼虫蛀果率和死亡率的影响；其中(a)是初孵幼虫在处理纳米-rna制剂后的蛀果率；(b)是初孵幼虫在处理纳米-rna制剂后的死亡率。

图3为本发明实施例4中神经肽npf1a的纳米-rna制剂喷雾法对梨小食心虫的影响；其中(a)是梨小食心虫喷雾处理48h后的取食选择测试结果图；(b)是是梨小食心虫四龄幼虫喷雾处理后的蛀果率结果图；(c)是梨小食心虫初孵幼虫喷雾处理后的死亡率结果图；(d)是梨小食心虫初孵幼虫喷雾处理后的蛀果率结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所有的统计均用spss22.0软件进行分析。两者间的差异统计利用apairwisestudent’st检验(p*<0.05,p**<0.01,p***<0.001).对于基因干扰实验中幼虫选择吃食物的数量的比较采用卡方检验(p***<0.001)。

供试梨小食心虫的幼虫，来自中国农业大学植物保护学院昆虫系ipm实验室人工饲养的种群，选取生活力较强的梨小食心虫幼虫，当天使用。梨小食心虫的成虫饲养在一次性透明的塑料盒中，雌虫产卵在盒壁上，然后塑料盒剪成不同的卵卡放在装有苹果的新的透明塑料盒中，饲养在设置光周期为14h光照：10h黑暗，温度为25±2℃和70％相对湿度的人工气候培养箱中(pxz-430b，中国宁波江南仪器厂)。

实施例1dsrna的合成

合成npf1a和egfp(对照)的dsrna的引物显示在表1中。依据megascripttmt7高转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司，维尔纽斯，立陶宛)说明书分别合成两个基因的dsrna。用nanodrop2000测dsrna的浓度，并用depc水稀释到终浓度5μg/μl，置于-80℃下备用。

表1合成gmolnpf1a双链rna的引物

实施例2神经肽npf1a的纳米-rna制剂局部点滴对四龄幼虫取食行为的影响

纳米微粒nanocarrierspc的原料已经商业化和低成本，并且其合成简便(lietal.2019)。本实施例选择了一种星状阳离子聚合物li4纳米载体，将其与合成的dsrna以1:1比例轻轻混合，使其终浓度为2.5μg/μl，然后加入1％容积的助剂-洗涤剂(表面活性剂)到配方中，活性剂可以降低亲水纳米复合物的表面张力，帮助纳米复合物快速附着于幼虫表皮(bernhardetal.1997；veldhuizenandhaagsman2000)。使用本发明提供的dsnpf1a、纳米载体(nanocarriers)和表面活性剂(detergent)三者的配方以局部滴加的方法处理四龄幼虫，每头四龄幼虫滴加1μl配方(2.5μgdsnpf1a)。使用dsegfp/nanocarriers/detergent处理的四龄幼虫作为实验的对照组。神经肽npf1a的纳米-rna制剂的配方示意图见图1的a。

(1)取食量的检测。用dsnpf1a/nanocarriers/detergent配方和dsegfp/nanocarriers/detergent配方分别处理40头四龄幼虫后，放在15g新鲜的人工饲料(chubbetal.2012)上继续饲养，48h后分别测其取食饲料量。再取15g新鲜的人工饲料作为蒸发计算的对照组。每个实验做三次生物学重复。

与对照组相比(平均值为2.62±0.26g)，处理神经肽npf1a的纳米-rna制剂48h的四龄幼虫的取食量(1.38±0.13g)(图1的b)显著下降了1.24±0.28g(p<0.05)。

(2)不同时间下四龄幼虫蛀果率的检测。用dsnpf1a/nanocarriers/detergent配方和dsegfp/nanocarriers/detergent配方分别处理40头四龄幼虫后，放在梨果上饲养，处理后24h，48h和72h分别记录其蛀果的幼虫数量。实验设置为三次生物学重复。蛀果率(％)＝蛀果幼虫数量/总幼虫数量*100。

与对照组相比，处理神经肽npf1a的纳米-rna制剂的四龄幼虫的蛀果率下降了50.44±5.73％(24h)、59.89±3.18％(48h)、69.33±2.18％(72h)(图1的d)(p<0.05)。

(3)行为实验检测。用dsnpf1a/nanocarriers/detergent配方和dsegfp/nanocarriers/detergent配方分别处理40头四龄幼虫，放在梨果上饲养，48h后进行取食行为测试。四片梨果实(1cmx1cmx1cm)放在一个9cm直径的培养皿的四个等角上，一头四龄幼虫放在培养皿的中心，然后记录在5分钟内，四龄幼虫寻找到梨果实的时间及选择吃果实的数量。每个实验三次生物学重复并三次平行重复。所有的实验均在温度为25±2℃的行为室里进行。

行为实验检测发现，与对照组相比，处理组选择不吃梨果的幼虫数量显著增加了一倍(p<0.0001)(图1的c)。

实施例3神经肽npf1a的纳米-rna制剂局部点滴对初孵幼虫的影响

1、神经肽npf1a的纳米-rna制剂对初孵幼虫蛀果和死亡率的影响

选择5μg/μldsnpf1a(dsegfp)与5μg/μlnanocarriers1:1混和，然后加入1‰容积的detergent的混合配方进行初孵幼虫的相关实验。每60头初孵幼虫分别被处理dsnpf1a/nanocarriers/detergent和dsegfp/nanocarriers/detergent配方，三次生物学重复，处理后用梨果实进行饲养，统计0h,12h,24h,36h,48h和60h处的初孵幼虫npf1a的死亡率和蛀果率。[蛀果率(％)＝(总初孵幼虫数量-没有钻果初孵幼虫数量-初孵幼虫死亡数量)/总初孵幼虫数量×100]。

如图2所示，与对照组初孵幼虫(5μg/μlnanocarriers/5μg/μldsegfp/10-3detergent)相比，处理5μg/μlnanocarriers/5μg/μldsnpf1a/10-3detergent后60h内初孵幼虫的蛀果率下降了66.34-74.70％(p<0.0001)(图2的a)，而初孵幼虫的死亡率显著增加到66.67％(p<0.001)(图2的b)。

实施例4神经肽npf1a的纳米-rna制剂喷雾法对幼虫的影响

1、pet30-bl21(de3)rnaseiii-系统批量生产dsnpf1a

为了进一步推广神经肽npf1a的纳米-rna制剂在田间的应用，本发明首次构建npf1a-pet30-bl21(de3)rnaseiii-系统，解决dsrna的大量合成。设计npf1a的左右片段的上下游引物，如seqidno.6-9所示。

用ecorⅰ-xbai酶消化186bppcr产物生成npf1a-l，用xbaⅰ-xhoⅰ酶消化213bppcr产物生成npf1a-r。npf1a-r末端有一个27bpdna序列形成茎环结构。

npf1a-l和npf1a-r的片段克隆到pet-30a载体(tiandz,china)上，生成重组pet30-npf1a表达载体。重组载体pet30-npf1a再转入bl21(de3)rnaseiii表达感受态细胞(来源中国农业大学植物保护学院)，通过单克隆摇菌，当od值达到0.6时加入1mmiptg诱导剂，37℃，220转下摇床里培养8h。菌液进行80℃孵育20min，8000转下离心5min，然后菌株用1xpbs配置的75％乙醇进行溶解，然后8000转下离心10min，150mmnacl悬浮离心所得沉淀5min，最后离心15min，上清液为粗提取的dsrna-npf1a(粗提取的dsrna-npf1a的序列如seqidno.10所示)。最后用1urq1rnase-freednase(promega)和适量rnaseasolution(2ng/μl)(promega)进行纯化。

粗提取的dsrna-npf1a的序列如seqidno.10所示：atgctgaacaagaacttcgccatcgctgtagccgttgtgctggcttgcgtgtgcctcgccgaggcgcgcgaggagagtccgcacgacatgtcggaggcgcttcgcatgcttcaggagttggatcgctactacactcaggctgctagacccaggttcggcaaacgctctgatgccttcacaaactgg(下划线所示碱基为形成茎环的27bp碱基)。

2、神经肽npf1a的纳米-rna制剂喷雾法对四龄幼虫取食和蛀果影响

选择4μg/μldsnpf1a与4μg/μlnanocarriers1:1混和，然后加入1％容积的助剂detergent的混和配方进行四龄幼虫的相关实验。每120头四龄幼虫分别喷雾法处理dsnpf1a/nanocarriers/detergent和nanocarriers/detergent和ddh2o，三次生物学重复，处理后用梨果实进行饲养。一个梨果实放在一个透明的长方形的塑料盒(25cmx15cmx15cm)的一个夹角，处理后的四龄幼虫放在梨果的对面，为了便于统计，每个长方形塑料盒里放入40头幼虫。(1)统计0h,12h,24h,36h和48h处四龄幼虫蛀果率[死亡率(％)＝四龄幼虫死亡数/总四龄幼虫数量x100]；[蛀果率(％)＝(总四龄幼虫数量-没有钻果四龄幼虫数量-四龄幼虫死亡数量)/总四龄幼虫数量×100]；(2)统计48h处四龄幼虫选择吃与不吃梨果的数量。

如图3所示，与对照组四龄幼虫(ddh2o和nanocarriers/detergent)相比，处理dsnpf1a/nanocarriers/detergent后48h内四龄幼虫选择不吃梨果的概率达到62.50％(图3的a)；蛀果率24h下降了63.33％,48h下降了54.44％(图3的b)。

3、神经肽npf1a的纳米-rna制剂喷雾法对初孵幼虫蛀果和存活影响

选择4μg/μldsnpf1a与4μg/μlnanocarriers1:1混和，然后加入1‰容积的detergent的混合配方进行初孵幼虫的相关实验。每120头初孵幼虫分别喷雾法处理dsnpf1a/nanocarriers/detergent和nanocarriers/detergent和ddh2o，三次生物学重复，处理后用梨果实进行饲养，统计0h,12h,24h,36h和48h处的初孵幼虫的死亡率和蛀果率。[死亡率(％)＝初孵幼虫死亡数/总初孵幼虫数量x100]；[蛀果率(％)＝(总初孵幼虫数量-没有钻果初孵幼虫数量-初孵幼虫死亡数量)/总初孵幼虫数量×100]。

如图3所示，与对照组初孵幼虫(ddh2o和nanocarriers/detergent)相比，处理dsnpf1a/nanocarriers/detergent后48h内初孵幼虫的蛀果率下降了58.89％(图3的d)，而初孵幼虫的死亡率显著增加到60％(p<0.05)(图3的c)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种可预防梨小食心虫幼虫蛀果取食的纳米-rna制剂

<130>khp201117005.7

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gaggcgcgcgaggagagtccgcacgacatgtcggaggcgcttcgcatgcttcaggagttg120

gatcgctactacactcaggctgctagacccaggttcggcaaacgctctgatgccttcaca180

aactgg186

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