植物线虫常用保存和标本制作方法

植物线虫常用保存和标本制作方法
摘要：为了进行线虫的分类鉴定，便于观察线虫细微的形态结构，通常要将标本进行长期保存或制成长期玻片。

本文将介绍几种常见的保存和标本制作方法。

关键词：植物线虫；保存；标本制作
1 植物线虫的保存方法
1.1 线虫的杀死
线虫分离后可以直接检查，如果样本需要保存，就要将线虫杀死并固定，防止变形变质。

1.1.1 一般都采用加热的方法杀死线虫。

杀死少量线虫，可以把线虫挑或吸到载破片上的水滴中，通过火焰下方加热即可杀死。

大量的线虫，可以在皿内通过火焰，边加热边观察，到线虫突然伸直停止活动，或呈弓形或螺旋形时，停止加热，观察到虫体仍不活动方可认为杀死线虫。

1.1.2 也可以用热水浴杀死，在线虫悬浮液放入水浴锅中，加温至56-58℃，3min后放入冰箱或室温自然降温，待悬浮液冷却后立即加固定液固定。

1.2 线虫的固定
需要保存或需用电镜观察的线虫，应在杀死后立即进行固定。

固定的目的是为了防止虫体的变形和变质。

1.2.1 固定液种类很多，2%-4%的甲醛液是一种常用的固定液，优点是配制简单、使用方便，线虫在这种固定液中可以长期保存，
缺点是时间长了有可能使虫体内部形成颗粒
1.2.2 三乙醇胺福尔马林液（taf）是另一种适用的线虫固定液，配制方法如下：福尔马林（40%甲醛）7ml，三乙醇胺2ml，蒸馏水91ml。

这种固定液是认为较好、用得较普遍的固定液，优点是固定速度快，虫体固定后虫态逼真，可较长期保存。

但时间过长，会导致一些线虫内部结构透明和表皮角质膜变质，
2 植物线虫长期标本的制作
2.1 脱水
制作永久玻片和半永久玻片的线虫需要固定后脱水，而且用于脱水的线虫必须固定24小时以上。

一般用甘油法，也有用乳酚油处理的。

2.1.1 甘油酒精脱水法，配置方法如下：
甲溶液：95%酒精20ml，甘油1ml，蒸馏水79ml；乙溶液：95%
酒精95ml，甘油5ml；取固定24h以上的线虫故进盛有甲溶液的小皿内。

将小皿放进干燥器隔板上或其他较大的玻璃器皿内，干燥器底部（或玻璃器皿中）放95%酒精，加盖后置35-40℃温箱内12-24h，取出小皿，换进乙溶液，将小皿放在密闭的大器皿内，40℃温箱内保存3h或更长，待酒精完全蒸发，线虫已完全脱水。

这种方法脱水完全，虫体不变形，可以制成永久玻片长期保存。

线虫在甘油中保存的时间长，几乎是无限期的，而且光学效果比乳酚油的玻片好。

2.1.2 乳酚油处理的速度比用甘油的快，线虫在乳酚油中染色的效果也很好，制片后如果玻片封固良好，可以保存多年。

配置方法
如下：苯酚（液体）500ml，乳酸500ml，甘油1000ml，蒸馏水500ml 如果需要染色，在上述溶液中加入事先溶好的棉蓝或酸性品红液，使之成为含有0.0025%—0.01%棉蓝（或酸性品红）的乳酚油。

脱水时，取含染料的乳酚油一滴滴入凹玻片，在电热板上加热到60—70℃，转入固定好的线虫，保持2-3min，解剖镜下检查虫体至透明后停止。

2.2 蜡圈的制作
蜡圈是封固玻片保持标本长期不变形的关键。

准备直径1.5cm.
长10cm的打孔器，低熔点的石蜡（熔点54℃），末端用软木塞固定。

把打孔器端部在酒精灯火焰上加热约10min，趁热迅速插到蜡盘中蘸取少许石蜡。

将熔化的蜡尽快粘附在洁净的载玻片中央，即做成一个蜡圈。

如果第一次蘸取的石蜡太少，可按上述步骤重复2-3次。

2.3 棉蓝乳酚油和乙醇甘油制片法
棉蓝乳酚油制片法具体步骤如下：在载玻片蜡圈中加一小滴未加热的棉蓝乳酚油，把凹玻片上经过加热染色的线虫挑至其中，并使线虫沉底，排列整齐。

在蜡圈和棉蓝乳酚油液滴之间加3根短尼龙丝或玻璃丝作支撑物，共粗细与虫体直径大致相等。

加22mm×22mm 盖玻片，然后把玻片放到同样温度的电热板上加热，待蜡团熔化无气泡时取下冷却。

2.4 根结线虫会阴花纹破片制作
解剖镜下从病根内分离出雌虫。

为了便于区别雌虫与植物根组织，可以用含有0.1%的棉蓝或酸性品红的乳酚油液浸病根72h，线
虫着色为蓝色或红色，再分离雌虫。

选择发育健壮的雌虫若干，移到透明塑料载片的45%乳酸中，以锋利小刀切下虫体后端，用专用细铁挑针或竹针尖端的纤丝仔细剔除附在内侧的卵及其他粘连物，并稍加修整，留下需要的角质膜块。

移角质膜块到另一滴乳酸中，漂洗1-2次，转移到干净载玻片的纯甘油滴内，使表面向上，加盖玻片，用封固剂封固边缘。

2.5 胞囊线虫阴门椎的制作程序
将胞囊线虫的胞囊在培养皿内用水浸泡24h，用细毛笔将浸过的胞囊移至载玻片一侧的水滴中，在体显微镜下用锋利的解剖刀切下胞囊后部的阴门椎部分，用竹针仔细清除阴门椎内附着物，用刀适当修整阴门椎边缘，最好使阴门椎的高度不超过阴门窗区域宽度的10-15倍。

将阴门椎依次移至玻片另一例的70%、95%、100%酒精液滴中脱水，把脱水后的阴门椎转移至凹玻片的凹穴中的丁香油内透明，在薄的凹玻片的凹穴内加一小滴中性树胶，稍涂平。

将处理好的阴门推埋于薄层中性树胶内。

待中性树胶凝固后，再在阴门椎附近加入适量的中性树胶，并加盖玻片。

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