Plant Cell. 小麦籽粒发育过程中翻译调控研究

导读：
作物籽粒中基因表达的动态往往在转录水平上进行研究。但是，也因此忽略了翻译水平上的调控。翻译调节一种快速调节基因表达以增加生物体可塑性的广泛机制，应当引起关注和重视。

本研究采用Polysome profiling分析和核糖体印记技术（Ribo-seq），以获得面包小麦谷物发育中的整体翻译组数据。并进一步研究了谷物发育过程中的全基因组翻译动态，揭示了许多功能基因的翻译以特定阶段的方式进行调节。亚基因组间的不平衡翻译普遍存在，因此增加了小麦异源六倍体表达的灵活性。

此外，作者揭示了长链非编码RNA中广泛存在的未注释的翻译事件，包括上游开放阅读帧(uORF)、下游开放阅读帧(dORF)和开放阅读帧(ORF)，并表征了小ORF的表达动态；证实了uORF作为顺式调控元件，可以抑制甚至增强mRNA的翻译。基因翻译可能由uORF、dORF和microRNA组合调节。

总之，本研究揭示了面包小麦谷物在发育过程中全面且详细的翻译调控。对促进未来作物改良以获得最佳产量和质量具有重要意义。

文章索引
标题：The translational landscape of bread wheat during grain development.
发表期刊：Plant Cell
发表时间：2023.03
作者及团队：中国农业大学农学院彭惠茹教授团队
IF：11.60
DOI：10.1093/plcell/koad075.

研究结果
（1）基于Polysome profiling分析和Ribo-seq的小麦籽粒时间序列翻译组数据
为了在全基因组范围内表征籽粒发育过程中基因的翻译动态，作者对小麦籽粒在连续发育阶段(开花后5天、10天和15天)的总mRNA (RNA-seq)、Polysome-bound mRNA (Poly-seq)和核糖体保护mRNA片段(Ribo-seq)进行了测序(图1A）。Ribo-seq的质控包括了RFs片段的长度和三碱基周期性（图1B-C）。

作者分析了不同发育阶段的多聚核糖体谱（图1D）。

此外，对所有样本进行了主成分分析(PCA)，发现PC1可区分RNA-seq(总mRNA/转录)，Poly-seq(PolysomemRNA/翻译)和Ribo-seq (RF/翻译)的样本，而PC2(20.8%的变异)则可区分出发育过程(图1E)。

（2）谷物发育过程中基因表达存在阶段特异性翻译调控
为了全面了解谷物发育过程中的转录和翻译动态，作者在代表不同发育阶段的3种类型文库中鉴定了33,815个差异表达基因(DEG)，占表达基因的64.1%。接着进一步对这些差异基因丰度进行了共表达分析，得到6个共表达簇(图2A），其中簇5和簇6的转录组和翻译组之间表达模式不一致，这意味着翻译调控可能改变了某些基因的表达。
通过翻译状态（TS，同常说的翻译效率，TS=polysomal mRNA/total RNA）的分析，发现从5DAA到10 DAA，95%的基因转录本丰度变化超过25倍，TS则发生了更大的变化(32倍)(图2B)；从10 DAA到15 DAA时，观察到相反的情况(即转录本丰度比的变化大于TS比的变化)(图2C)。

接着，对差异翻译基因进行基因本体(GO)富集分析。903个与籽粒发育相关的基因中，几乎一半的基因改变了TS (P = 3.4e−13)(图2D)。这些基因的翻译表达模式如图2E)。通过对数个已知基因的表达模式分析(图2F-G)，表明在谷物发育过程中，功能基因受到广泛的翻译调控。

（3）翻译调控的亚基因组不对称增加了小麦同源基因之间的表达差异
进一步分析发现小麦亚基因组间发生了翻译调控的分化，亚基因组翻译不平衡与籽粒发育进程相关，提高了异源六倍体小麦基因表达调控的可塑性。

接下来，作者使用Ribo-seq数据鉴定全基因组ORF(图4A)。在参考基因组的蛋白质编码基因中共鉴定出81,488个注释ORF (aORF)。此外，发现了3,360个未注释的ORF可能编码肽，包括1,254个在5'UTR中的uORF, 367个在3'UTR中的dORF, 825个在注释的CDSs中但在不同的阅读框中的内部ORF (iORF)，以及914个在lncRNA(lORF)中的ORF。

作者发现大多数未注释的ORF序列比CDSs中的ORF更短(图4B)， 21.6%的未注释ORF具有非AUG启动密码子(图4C)。

另外，从新发现的uORF、dORF、lORF和iORF中共鉴定出1883个sORF(可编码短肽)。作者在翻译水平上表征了这些sORF的表达动态，获得了代表不同表达模式的5个sORF共表达簇(图4D)。例如，簇C3中的基因可能在谷物的早期发育中起重要作用，因为它们在5-DAA谷物中含量更高。进一步的亚细胞定位分析预测了636个ORF含有信号肽，28个ORF含有叶绿体转运肽，76个ORF含有线粒体转运肽(图4E)。这些发现强调了鉴定的sORF可能具有功能性表达。

对几个单独转录本的分析表明，无论是已注释的ORF(图4F)还是新鉴定的ORF(图4G-H)，在编码区域都有核糖体和Polysome占据的信号。

面包小麦中uORF是否可以影响主要ORF (mORF)的翻译呢？
为此，作者利用RNA-seq和Ribo-seq数据计算了ORF的翻译效率(TEs)。结果发现，具有uORFs的mRNA的TEs低于没有uORFs的mRNA(图5A)。

此外，含有AUG启动密码子的uORF比含有非AUG启动密码子的uORF具有更高的TE，并且含有AUG启动密码子的mRNA比含有非AUG启动密码子的mRNA具有更低的TE(图5B)，这意味着AUG启动密码子可能对mORF丰度具有更强的抑制作用。

Kozak序列在生物体的起始密码子识别和翻译起始中起着重要作用。作者没有在uORF中观察到预期的高度保守的Kozak序列特征(图5C)，

而且，一些uORF与mORF的翻译呈负相关，如钙调磷酸酶b样蛋白9 (CBL9) 、ila1相互作用蛋白4 (IIP4) 、SHOU4和DDB1-CUL4相关因子1 (DCAF1) (图5D)，这表明uORF具有抑制作用。

作者使用双荧光素酶(LUC)系统和RT-qPCR分析发现两个选定的uORF可抑制下游mORF的翻译，但对转录没有影响（图5E，G-I）。

特别地，作者也一些uORF可以增强mORF的翻译，但其机制尚不清楚（图5F，J-K）。

MicroRNAs (miRNAs)在作物基因翻译中的作用是什么？
为了确定miRNA对小麦基因表达的影响，作者获得了14441个推测的miRNA靶点，发现miRNA靶点的转录表达水平低于没有miRNA靶点的mRNA(图6A)。

在翻译水平分析miRNA靶点的转录丰度时则发现了更大的差异(图6B-C)。具有miRNA靶点的mRNA具有较低的翻译表达水平(图6B)和较低的TSs(图6C)，突出表明miRNAs可能通过抑制翻译下调基因表达。

根据已公开小RNA测序数据，作者分析了几个miRNA的表达与其下游靶标翻译减少相关的例子(图6D-E)。miRNA，包括miR156、miR172、miR846、miR1142和miR857，在谷物发育过程中改变了表达水平(图6D)。进一步分析表明，miRNA的丰度变化模式与其预测靶标的TSs相反，这表明这些miRNA可以抑制预测靶标的翻译(图6E)。

鉴于miRNA和uORFs都可以在翻译水平下调基因表达，作者还研究了miRNA靶位点和uORFs的位置，发现二者在mRNA中有很高的共发生比例(图6F)，表明uORFs和miRNAs倾向于共调节共享mRNA。

为了进一步研究miRNA和uORF在翻译水平上对基因表达的组合作用，作者根据uorf(分别为u+或u-)或miRNA靶位(分别为m+或m-)的存在与否，将基因分为4组:“u- m-”、“u+m-”、“u-m+”和“u+m+”。与其他mRNA组相比，“u−m−”mRNA具有更高的TSs，如预期的那样(图6G)。与“u - m -”mRNA的TSs相比，“u+m -”mRNA和“u - m+”mRNA的TSs均降低，“u+m+”mRNA的TSs最低。

dORFs还可以增强mRNA的翻译，因此，假设dORFs可能会减弱uORFs或miRNAs对翻译的抑制作用。最后发现与“u+d-”和“m+d-”mRNA的TS相比，“u+d+”mRNA和“m+d+”mRNA具有更高的TS(图6H)。这些观察结果表明，uORFs和miRNAs可能倾向于联合抑制基因翻译，而dORFs的存在可能在一定程度上增强mRNA的翻译。

研究结论
该研究综合Ribo-seq、Polysome-seq和RNA-seq的数据，构建了小麦籽粒发育的翻译组图谱，全面解析了籽粒发育的翻译调控机制，揭示了控制籽粒发育的翻译调控元件，为未来小麦产量和品质基因的精准调控提供了新方案。

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