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越南金花茶化学成分差异及基于表型性状的亲缘关系分析

来源：花匠小妙招时间：2024-12-25 20:40

摘要：目的对越南金花茶Camelliainsularis 化学成分及表型性状进行分析，明确其化学成分差异及基于表型性状的亲缘关系，为越南金花茶种质分类和良种选育提供依据。方法采用超高液相色谱法建立样品化学指纹图谱，目测和直尺观测表型性状，基于液相色谱峰数量和面积，采用主成分分析、相关分析和聚类分析方法，对越南金花茶化学成分差异及亲缘关系进行评价。结果主成分分析结果表明，以色谱峰数量为评价指标，YN3-78 、YN3-77 、YNX3-15 、YN3-72 、YN3-62 等综合评分较高；以色谱峰面积为评价指标，YN3-60 、YNX3-05 、YNX3-01 、YNX3-14 、YNX3-04 等综合评分较高。相关分析结果显示，各表型性状与化学成分间存在显著相关。聚类分析结果表明，77 株越南金花茶可分为4 个类群，其中，第1 群13 株，属大叶型，化学成分出峰时间多在19.32 min 以前，色谱峰数量较少、峰面积较高。第2 群26 株，包含所有线形叶植株，属大叶型，化学成分出峰时间多在15.21 min 之前，色谱峰数量最少。第3 群19 株，叶面积较小，化学成分种类少，峰面积低，综合指标最差。第4 群19 株，叶面积最小，该群23.33 min 以后有出峰，是区别于其他类群的重要特征；该群化学成分数量最多，峰面积均较低。结论越南金花茶表型和化学成分均具有较大差异，通过聚类分析所得4 个类群均有各自明显的表型性状特征；表型与化学成分存在显著相关，可通过表型性状预测化学成分种类和含量。该结果可为越南金花茶亲缘关系分析和优良种质筛选提供重要依据。

金花茶CamelliaPetelotii (Merril) Sealy 为山茶科山茶属金花茶组小乔木[1]，属世界珍稀濒危植物，国家一级保护植物[2]，被誉为植物界的“大熊猫”[3]。金花茶为广西传统药用植物及壮族传统民间用药[4]，具有广泛的生物活性和重要的药用价值，《广西壮自治区壮药质量标准》（第2卷）[5]记载，金花茶具有清热解毒、利尿消肿作用，主治肾炎、水肿、尿路感染、咽喉炎、痢疾、高血压等病。体内及体外药理研究证明金花茶具有抗氧化[6]、抗肿瘤[7-8]、调血脂[9-10]、降血糖[11]、抗皮肤光老化等多种药理作用，具有极高的药用价值和经济价值。

金花茶20 世纪60 年代初首次在广西发现，现全世界已发现的金花茶组植物有42 个种5 个变种，主要分布于我国广西南部以及越南北部[12] ，个别种零星分布或栽培于我国云南和贵州[13] 及缅甸、泰国、马来西亚和日本等[14] 。越南金花茶Camellia insularis Orel et Curry 资源总量不多，但品种较丰富，目前已发现金花茶品种22 个，与我国金花茶主产区广西接壤的越南北部地区，是越南金花茶主要分布中心[15] 。越南金花茶抽芽和花期均较国内金花茶早，对气温的要求略高[16] ，多数引种至国内的越南金花茶均会受不同程度的冻害，但次年仍能从保留的主干中抽梢生长 [17] ，表现为对广西生态环境的适应性[18]。越南金花茶花径和单花鲜质量均高于大多数国内原生金花茶品种[19]，较之广西本地金花茶，越南金花茶叶片药用价值更高[15,20-21] ，为发展和壮大金花茶产业，可加大对越南金花茶的引种栽培和优良品种选育。

从资源分布量来看，全世界90%以上的野生金花茶分布于中国广西防城港市十万大山的兰山支脉一带[22]，因此，2009年防城港区被中国经济林协会命名为“中国金花茶之乡”。为保护金花茶资源，促进其开发利用，防城港市大力支持金花茶种植和开发产业，现防城金花茶种植面积达3300 hm 2 。防城港市东兴市东兴天之麟农业科技有限公司发展金花茶种植和育苗基地450 hm 2 ，种植金花茶130万株，涉及国内金花茶品种21个，引种越南金花茶133 hm 2 。由于金花茶品种繁多，引种的越南金花茶品种因未经选育，多品种混杂对金花茶管理及产业发展带来一定的影响[23]，因此，明确其种质差异，筛选优良种质具有重要意义。植物表型性状的鉴定和描述是种质资源研究最直接、最基本的方法和途径[24] ，本实验根据金花茶表型性状差异，从东兴天之麟农业科技有限公司金花茶种植基地选择77株越南金花茶，分析其化学成分差异及基于表型性状分析其亲缘关系，其结果可为了解越南金花茶遗传特性及筛选优良种质提供参考和依据。

1材料与仪器

1.1材料

1.2仪器与试剂

超高效液相色谱仪（美国Waters公司，包括WatersFIN样品管理器，QSM四元溶剂管理器，TUV Detector检测器，Empower色谱工作站），KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），密理博超纯水机（苏州赛恩斯仪器有限公司）。

2方法

对挂牌植株，观察其叶片表型性状，取最外层分枝上已成熟转绿的叶片，冻干后粉碎，过3 号筛用于化学成分分析。

2.1叶片形态指标测定

观察叶形、叶尾和叶基形态、叶细脉数，测量叶长、叶宽、叶柄长，计算叶面积，每株观察5 片，取平均值。

2.2采用超高液相色谱法测定金花茶化学成分

2.2.1色谱条件以ACQUITYUPLC HSS T3（100 mm×2.1mm，1.8 μm）为色谱柱；流动相为乙腈（A）-0.3% 甲酸水溶液（B ）；梯度洗脱：0 ～2 min ，14% ～15% 乙腈；2 ～12.5 min ，15% ～22% 乙腈；12.5 ～15.0 min ，22% ～22.5% 乙腈；15 ～28 min ，22.5% ～25% 乙腈；28 ～33 min ，25% ～60% 乙腈；33 ～37 min ，60% 乙腈；柱温35 ℃；体积流量0.2 mL/min ，检测波长260 nm 。

2.2.2对照品溶液的制备对照品采用甲醇溶解后制成5 mg/mL 的母液。用时将母液稀释，制成分别含各对照品0.2 μmol/L 的混合对照品溶液。

2.2.4 标准曲线制作混合对照品分别设0 、0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 μmol/L 7 个进样梯度，测峰面积，以进样量为横坐标（X ），对应含量为纵坐标（Y），采用excel制作线性回归方程，测得各对照品线性范围。对照品线性回归方程R2＞0.999 ，标准曲线线性关系良好，见表1 。

方法学考察结果显示精密度、重复性、稳定性、加样回收率良好，RSD 均＜0.05 。

2.3数据统计分析

2.3.1色谱峰纳入标准越南金花茶叶50%乙醇提取液峰面积达2000以上的色谱峰有85个，化学成分为已知的峰有16个。理论上每一个峰对应一个化学成分，峰面积与相应化学成分的含量成正比。以单个样品峰的有无（有记为“1”，无记为“0”）代表某个化学成分的有无、以峰面积代表化学成分含量纳入统计分析，对77株金花茶的化学成分和亲缘关系进行评价；选择成分已知的16个峰及峰面积达10 000以上的28个未知峰与叶表型性状进行相关分析，获取与化学成分相关的表型性状。

2.3.2非数值型性状数据转换将非数值型性状叶形、叶尾形态、叶基形态、叶细脉数进行哑变量转换，转换值见表2，转换后的数据与叶面积、叶柄长、色谱峰数量、色谱峰面积一并录入总表后进行统计分析。

2.3.3数据统计分析所有数据进行标准化转换后，利用R语言（R×643.6.2）软件，采用基于欧氏距离（Euclidean distance）离差平方和法的层次聚类法进行聚类，利用SPSS 13.0软件对其进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和Pearson相关分析，Excel对综合得分值进行作图。

3结果与分析

3.1越南金花茶表型差异

越南金花茶表型性状丰富，主要体现为叶形多样，大小不一。所试金花茶叶形主要包括矩圆、线形、椭圆形、长椭圆形4个类型（图1-A），叶基形状有圆钝和下延2种（图1-C），叶尾形状有尾尖、渐尖、凸尖、锐尖4种（图1-C），叶脉差异主要体现为细脉数量和脉的深度（图1-B）。结果显示，叶形以矩圆叶占多数，达41.56%，线形叶最少，仅占10.39%；叶尾以尾尖最多，占比33.37%，余下3种类型数量相当；下延型叶基较多，占比57.14%，细脉多型叶为多数，占比59.74%。结果显示，越南金花茶叶面积最小值仅15.90 cm 2 ，最大值136.50 cm 2 ，变幅达120.60 cm 2 ，RSD为35.81%；叶柄长最小值0.30 cm，最大值1.80 cm，变幅达1.50cm，RSD为34.94%，无论是叶面积还是叶柄长，各株系间差异均较大。

3.2越南金花茶化学成分差异评价

3.2.1化学成分含量差异从所试77株样品中检测到85个化学成分，其中已知峰16个，其含量差异信息见表3。由表3可知，16个成分含量最小值均为0，表明并不是所有株系均含该16个成分；RSD值最小36.29%，最大达263.35%，株系间含量变异极大，可以预测该基地越南金花茶的来源极其复杂。根据最大值和平均值可知，越南金花茶含量较高的成分有槲皮苷、表儿茶素和绿原酸，最大值分别为6.842% 、6.736% 和3.319% ；平均值以表儿茶素最高（0.783%），其次为绿原酸（0.629%），槲皮苷排第3位（0.499%），其余成分的含量均较低。

3.2.2越南金花茶代表类型液相色谱图受试77株越南金花茶色谱峰数量、峰保留时间和峰面积均存在较大差异，各出峰类型代表图谱见图2，对照图谱见图3。由图2可知，S1类型化学成分集中在保留时间15 min之前；保留时间23 min以后只有S2和S3有出峰，且二者出峰类型存在差异；S4和S5出峰时间集中在21 min前，所出峰的峰面积差异较大。从图2可知，越南金花茶化学成分和含量均具有较大的差异，推测其种质来源较为多样。

3.2.3基于色谱峰数量差异的越南金花茶化学成分评价将77 株越南金花茶色谱图中各色谱峰的有无做成0-1 矩阵，1 代表有，0 代表无，采用SPSS 做因子分析，最后方差大于1 的因子有22 个，可被作为主成分进行分析，22 个因子的总特征值和方差贡献率见表4 。根据表4 ，第1 主成分特征值为15.392 ，占总方差的18.544% ，22 个主成分累积方差占总方差的81.467% 。根据22 个主成分的因子得分，乘以相应方差的算术平方根计算出主成分的得分；利用每个样品各主成分得分乘以该主成分的贡献率（方差/22 个因子的总方差）之和，计算各样品得分顺序，各样品综合得分值见图4。从图4可知，编号为YN3-78、YN3-77、YNX3-15、YN3-72、YN3-62、YNX3-06、YN3-61、YN3-67、YN3-80、YN3-71主成分综合评分排前10位，说明该10株金花茶的化学成分种类较多，如果以化学成分的数量为评价指标，该10株较为优质。

3.2.4基于色谱峰面积差异的越南金花茶化学成分评价根据77株越南金花茶各色谱峰面积的大小，采用SPSS做因子分析，最后方差大于1的因子有11个，可被作为主成分进行分析，11个因子的总特征值和方差贡献率见表5。根据表5，第1主成分特征值为8.42，占总方差的19.137%，11个主成分累积方差占总方差的85.588%。根据11个主成分的因子得分，乘以相应方差的算术平方根计算出主成分的得分；利用每个样品各主成分得分乘以该主成分的贡献率（方差/11个因子的总方差）之和，计算各样品得分顺序，以评价样品基于化学成分含量指标的优劣，各样品综合得分值见图5。从图5可知，编号为YN3-60、YNX3-05、YNX3-01、YNX3-14、YNX3-04、YNX3-27、YNX3-23、YNX3-10、YNX3-12 、YNX3-07 主成分综合评分排前10 位，说明该10 株金花茶的化学成分含量较高，如果以化学成分的含量为评价指标，该10 株较为优质。

3.3化学成分与叶表型性状的相关分析

对16 个已知化学成分及峰面积大于10000 的28 个未知成分，与叶表型性状做相关分析，其中与叶表型性状具有显著相关的成分共39 个，结果见表6 。由表6 可知，入选的表型性状，均有化学成分与之存在显著相关关系。其中，与叶形显著相关的成分共有16 个，矩圆形叶与11 个成分呈显著正相关，与3 个成分呈显著负相关；线形叶与异槲皮素呈极显著正相关；长椭圆叶与4 个成分呈显著负相关，与1 个成分呈显著正相关。叶尾形态与13 个成分呈显著相关，其中，有4 个成分与锐尖叶呈显著正相关；只有1 个成分与凸尖叶呈显著负相关；5 个成分与尾尖叶成显著正相关、5 个成分与尾尖叶呈显著负相关。叶基形态与18 个成分存在显著相关关系，其中与下延呈正向相关的7 个，该类成分出峰时间多数较迟；以圆钝为正向（相关系数为负）相关的11 个。叶细脉数与19 个成分具有显著相关关系，其中10 个为正相关，细脉多含量高；9 个为负相关，细脉少含量高。与叶面积呈显著正相关的成分有7个，呈显著负相关的10个。与叶柄长呈显著正相关的成分有8个，负相关的有8个。整体来看，出峰时间在23 min以后的成分如木犀草素、槲皮素、山柰酚等，与矩圆形叶均呈显著负相关，叶基下延、叶细脉数中等、叶面积小、叶柄短，具小叶形品种的特征，表明23 min以后有出峰的品种类型可以根据这几个表型性状进行筛选。尾尖叶和锐尖叶与槲皮苷的相关系数正负相反，但大小几乎相等，可以推断，具锐尖叶的品种槲皮苷含量高，具尾尖叶的含量低。出峰较早的几个成分WZ0、没食子酸、WZ2、WZ3、绿原酸、儿茶素等，与矩圆叶、叶细脉数、叶面积、叶柄长均呈显著正相关。综合以上，欲筛选木犀草素、槲皮素等黄酮类物质含量高的品种，宜选择小叶型、叶基下延、非矩圆形品种；欲筛选没食子酸、绿原酸、儿茶素等含量较高的品种，宜选择大叶、细脉多而深的品种。

3.4样本亲缘关系分析

基于叶表型性状及16个已知化学成分和28个峰面积大于10000 AFU*s未知成分的峰面积，各类群中表型性状频度及16个已知化学成分含量平均值见表7。采用基于欧氏距离离差平方和法的层次聚类法对77株越南金花茶进行聚类，结果见图6。由表7和图6可知，在距离17.5左右，77株金花茶可分成4个大的类群，其中第1群含13株，基形全为圆钝，细脉数多，叶面积大，叶柄长，属于大叶形品种；化学成分出峰时间多在19.32 min以前，绿原酸、儿茶素、金丝桃苷、染料木苷、水杨酸、槲皮苷几个成分含量在该类群中最高，属于成分类型较少、含量高的类型。第2群含26株，包括所有线形叶植株，叶面积大、叶柄长，属于大叶型；化学成分出峰时间在15.21 min之前，化学成分类型较少，绿原酸、异槲皮素为4个类群中最高，水杨酸和槲皮苷含量居第2，其余均为微量检出。第3群含19株，叶面积居第3位，叶较小；除表儿茶素和牡荆素含量最高、异槲皮素和山柰酚次高外，其余成分含量排位均较低。第4个类群含19株，基形全为下延，细脉数较少，叶面积小、叶柄短，属于小叶型。芦丁、WZ27和木犀草素为本群独有，23.33 min以后出峰的成分几乎均在本群；化学成分类型最多，但峰面积均较低。总体来看，根据聚类分析所得各群，均有各自的表型性状特征，且与相关分析结果基本一致，可基于表型性状区分各群和预测化学成分。

4讨论

金花茶非中国药典收载品种，其质量评价目前尚无统一标准。《广西壮族自治区壮药质量标准》（第二卷）[5] 以山柰素为其质量评价指标，但本课题组前期在对21 个金花茶品种（包括未经选育的越南金花茶品种）的研究中发现，除部分品种含有山柰素外，许多品种山柰素含量极难检出，不应作为质量指标用于评价整个金花茶组的质量。有文献研究报道金花茶含有多酚、多糖、黄酮、挥发性物质、皂苷等物质[25] ，但该类研究仍未成体系。金花茶的核心成分是什么？采用什么指标进行质量检测？如何评价金花茶的质量？是一个急需解决的问题。中药药效的发挥是多指标成分协同作用的结果，以往采用单个或少数几个指标评价中药质量具有一定的局限，如能尽可能多的采用多指标成分评价药材质量，结果会更为客观[26] 。高效液相色谱法在药材化学成分的研究中得到广泛应用，色谱峰可代表某化学成分的存在，而峰面积则可反映该化学成分的含量。通过评价药材色谱峰的数量和面积，可预估药材化学成分的丰度及各化学成分的含量，并评价药材质量。本课题组前期质谱研究结果显示，金花茶含有化学成分多达400种，不同来源金花茶，其化学成分的种类和含量均具有差异，本实验对原产地为越南并移植于广西防城金花茶化学成分的差异进行分析，发现在本实验检测条件下，可有效检出化学成分85个，不同株系间色谱峰种类和数量均存在显著差异。

药材有道地性之说，道地药材具有区域性特征，同时可在一定程度上反映药材的质量[27]。反过来说，不同地理来源的同品种药材，其质量存在差异。由于药材所含化学成分种类和含量均可能存在差异，如何综合评价药材质量，筛选优良种质和优势产地，是药材生产需要解决的关键问题。许多研究采用PCA法，基于因子综合得分排名判断药材质量[28]，但也有不同的观点认为该方法存在不足[29-30] 。在没有更好评价方法的前提下，本实验基于色谱峰数量和峰面积，采用PCA 分析77 株越南金花茶化学成分特征，对比综合得分结果与实际所测成分的结果显示，以色谱峰数量为评价指标的综合得分较高的样本，其实际成分也较多；以含量为评价指标综合得分靠前的样本，其化学成分含量也较高，结果一致性较高，可见该分析法可在一定程度上用于药材质量评价。综合来看，如何评价不同来源药材品种的优越性，应根据自身需要选择不同的方法，如以获得更多化学成分为目的，可采用成分类型（色谱峰数量）的多少为评价指标，如以获得某类成分为目的，应以该类成分的含量为综合评价指标。

药材化学成分的差异，主要受种质（基因）差异的影响，而表型性状是基因的外在反应，研究表型性状与化学成分的关系，可为种质分类和筛选提供简便有效的方法[31-32]。金花茶品种繁多，表型性状各异，许多药材性状与表型具有显著相关，使基于表型对金花茶种质进行分类鉴定成为可能[19,33-34]。本实验对越南金花茶的研究结果显示，出峰较早的化学成分如没食子酸、绿原酸、儿茶素等，与大叶、长柄、细脉数等呈正相关，基于聚类分析可知，该类成分含量较高的品种均聚在第1 类群，在基于峰面积PCA 的综合评分中得分较高。而第4 类群属小叶型，叶基全为下延，细脉数较少，23 min 后出峰的黄酮类化学成分基本在本群，槲皮素、木犀草素、芹菜素、山柰酚等成分均为本群特征成分；以峰面积为评价指标综合评分较低的植株基本在本群，但以色谱峰数量为评价指标综合评分较高的植株也基本在本群，表明本群化学成分数量较多，但含量均较低。综合来看，欲筛选木犀草素、槲皮素等黄酮类物质含量高的品种，宜选择小叶型、叶基下延、非矩圆叶型品种；欲筛选没食子酸、绿原酸、儿茶素等含量较高的品种，宜选择大叶、细脉多而深的品种。每一类化学成分均有其特定的药用功效，实际生产中可基于叶的表型性状预测其所含有效成分的类型和含量，有目的的去选育所需品种。表型性状受环境影响易发生改变，在良种选育过程中渐渐被舍弃或仅作为辅助手段，但本实验结果显示，非连续性表型性状均为质量性状，其遗传严格遵循孟德尔遗传规律，利用其初筛优良种质具有一定的现实意义。

广西分布最多的为防城普通金花茶，该品种的叶被列为国家新资源产品，此外，细叶金花茶、显脉金花茶、凹脉金花茶、大叶金花茶、倒卵叶金花茶等30 余个品种在广西被发现。有文献报道，防普通金花茶与越南种金花茶叶化学成分相比，越南金花茶的活性成分总含量更高[15] ，有的成分比防城普通金花茶高2 倍多，表现出极高的药用价值，具有很好的栽培与开发利用前景[21] 。国内金花茶与越南金花茶叶表型之间有十分明显的差异，越南金花茶大部分叶表型指标的平均值均显著大于国内金花茶[34] ，同时，越南金花茶的花径和单花鲜重均优于大多数国内原生金花茶品种，其产量性状优于国内金花茶。但本实验对包括越南金花茶品种在内的21 个金花茶品种的研究发现，每个品种均有各自的优势化学成分，没有哪个品种所有化学成分均比别的化学成分低。单从化学成分来看，各金花茶品种化学谱相差不大，但防城普通金花茶相对来说化学成分种类更多，越南金花茶高含量成分稍多，各具优势。鉴于金花茶品种及其化学成分的多样和复杂性，无论是越南金花茶还是本土金花茶，在品种选育中，均应根据产业发展需要，基于表型性状或各类检测手段，有目的的选育所需要的优势品种。

5小结

77 株越南金花茶表型性状和化学成分存在较大差异，表型性状与化学成分间具有显著相关。基于聚类分析的4 个群体含有的化学成分类型各不相同，化学成分的含量存在显著差异，且每一群均有各自的表型特征。具有推广应用价值的为第1 群和第4 群，第1 群主要特征为大叶，基形圆钝，没食子酸、绿原酸、儿茶素等化学成分含量较高；第4 群主要特征为小叶，基形下延，化学成分种类较多，木犀草素、槲皮素等黄酮类物质为本群特征性成分，实际生产中可基于叶的表型性状预测其所含有效成分的类型和含量，有目的的去选育所需品种。本结果可为越南金花茶的种质分类及优良种质筛选提供参考。

参考文献（略）

来源：何秋梅，高慧，白燕远，何志鹏，吴梦丽，侯小涛，邓家刚，谢阳姣．越南金花茶化学成分差异及基于表型性状的亲缘关系分析 [J]. 中草药, 2022, 53(2): 557-568.

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