首页分享青海高原地区小型兽类7种病原体携带情况调查研究

青海高原地区小型兽类7种病原体携带情况调查研究

来源：花匠小妙招时间：2024-12-25 16:37

小型兽类,如啮齿目、食肉目和兔形目等动物,是多种人兽共患疾病病原体的媒介生物,常携带的病原体有伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)和巴贝虫(Babesia spp.)等[1]。小型兽类的栖息活动范围与人类、家畜等活动区域密切相关,且受到人类行为的影响,进而增加人类感染病原体的可能性。青海高原地区,境内大小山脉纵横交错,物种丰富,现记录有小型兽类20多种,有子午沙鼠 (Meriones meridianus)、毛足鼠 (Phodopus roborovskii)、长尾仓鼠(Cricetulus longicaudatus)、小家鼠(Mus musculus)、大仓鼠(Tscherskia triton)、高原鼠兔(Ochotona curzoniae)、间颅鼠兔(Ochotona cansus)和松田鼠(Pitymys ierne)等,以鼠类为主[2,3,4,5],但对于青海省小型兽类携带病原谱目前还未见研究报道。为此,本研究采用 TaqMan 荧光 PCR 法检测伯氏疏螺旋体、问号钩端螺旋体、斑疹伤寒立克次体、恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体、土拉弗朗西斯菌以及巴贝虫,对其在小型兽类中的自然感染现状进行调查,掌握其携带相关病原微生物的基本情况,为动物源疾病风险评估和预警提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集及核酸提取

2018年6-7月在青海省海西蒙古族藏族自治州乌兰县希里沟镇、铜普镇和柯柯镇,格尔木市东城区,海北藏族自治州门源回族自治县青石咀镇、玉树藏族自治州囊谦县香达镇采用夹夜法,以花生米为诱饵,选择农田、林区、草场、半沙漠地和灌木丛等5种生境进行小型兽类标本采集。对捕获的小型兽类进行形态学鉴定后,无菌条件下收集脾脏、肾脏和肝脏组织,-80 ℃保存。

将脾脏、肾脏和肝脏组织剪碎放入EP管中,加入无菌PBS和钢珠,使用组织研磨仪(净信实业发展有限公司,上海)磨至均浆,用TIANamp Micro DNA Kit试剂盒(天根生化科技有限公司,北京)提取核酸。

1.2 细菌性病原体检测

使用ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(ABI,美国),对伯氏疏螺旋体、问号钩端螺旋体、斑疹伤寒立克次体、恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体以及土拉弗朗西斯菌进行检测。反应体系为20 μL:HRqPCR Master Mix(辉睿生物科技有限公司,上海)10 μL,引物(10 μmmol/L)0.8 μL,探针(10 μmol/L)0.4 μL,dd H2O 5 μL,DNA模板3 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s和55 ℃ 45 s,40个循环。设立阳阴性对照;观察扩增曲线和Ct值,以Ct值小于35且有明显扩增曲线,判为阳性。探针及引物[6,7](表1)均由中国疾病预防控制中心媒介生物控制室提供。

表1 检测病原体所用引物和探针序列

Tab.1 Sequence of primers and TaqMan probes used for pathogen detection

病原体引物探针序列(5'-3') 伯氏疏螺旋体正向引物 GTTCTGCAACATTAACACCTAAAGCTT 反向引物 AGGTGGGATAGCTGCTTTTATTGAT 探针 FAM-ACAGGATCAAGAGCATG-MGB 钩端螺旋体正向引物 CCCGCGTCCGATTAG 反向引物 TCCATTGTGGCCGR(A/G)
ACAC 探针 FAM-CTCACCAAGGCGAC-GATCGGTAGC-BHQ 斑疹伤寒立克次体正向引物 TGTTGATGGTGCAGGAT-TTGA 反向引物 CGAATTTGTAGCGACAGG-AAGA 探针 FAM-CAAACTGGCGCTGGTGT-MGB 噬吞噬细胞无形体正向引物 CCACGCAAGTCGCATTGAT 反向引物 GCCGGGTACTTTCGCAATT 探针 FAM-CTTACAGGTGCTATC-ATC-MGB 土拉弗朗西斯菌正向引物 GCAGGGCGAGCACCATT 反向引物 ATCTTGCATGGTCACCACTTGA 探针 FAM-CGATATTTGCCTGTTAGCACTCCT-MGB 恙虫病东方体正向引物 TTTYWGCTAGTGCRATA-GAATTRG 反向引物 CGCCAGTRATMATTCCTCCRA 探针 FAM-TAAGGACCACACTCT-AATC-MGB

1.3 巴贝虫检测

采用普通PCR方法扩增巴贝虫18S rRNA。正向引物为:5'-3'GTTTCTGMCCCATCAGCTTGAC;反向引物:3'-5'CAAGACAAAAGTCTGCTTGAAAC[8](由上海伯杰生物有限公司合成)。PCR反应体系为20 μL:2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)(全式金生物技术有限公司,北京)10 μL,引物(10 μmol/L)0.8 μL,H2O 6.4 μL,DNA模板 2 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖电泳鉴定后,将480~500 bp产物送至西安擎科生物技术有限公司测序。

1.4 核苷酸序列分析

将巴贝虫测序结果通过NCBI的BLAST程序与GenBank中注册的27株巴贝虫物种序列进行同源性分析,将疟原虫18S rRNA序列作为外群,采用MEGA 7.0软件绘制系统发育树。绘制方法为Neighbor-Joining法,选择Kimura 2-parameter模型,进行Bootstrap 1000构建。

1.5 统计学分析

用Excel 2016软件记录整理实验数据,SPSS 22.0统计软件进行统计学分析,病原体检出情况以例数和百分率表示,病原体检出率比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 小型兽类种类构成

本次调查共捕获小型兽类235只,分属于3目5科10属15种,长尾仓鼠(Cricetulus longicaudatus)77只,大林姬鼠(Apodemus peninsulae)48只,高原鼠兔(Ochotona curzoniae)25只,小家鼠(Mus musculus)23只,毛足鼠(Phodopus roborovskii)11只,子午沙鼠(Meriones meridians)11只,普通田鼠(Microtus arvalis)8只,仓鼠(Cricetidae)7只,间颅鼠兔(Ochotona cansus)6只,松田鼠(Pitymys ierne)6只,根田鼠(Microtus oeconomus)5只,五趾跳鼠(Allactaga sibirica)3只,灰仓鼠(Cricetulus migratorius)2只,林跳鼠(Eozapus setchuanus)2只,香鼬(Mustela altaica)1只。经性别鉴定,雌性116只,雄性109只,未鉴定出性别10只,雌雄比例为1.06∶1。

2.2 病原体检出率

对235只小型兽类进行了7种病原检测,其中肝脏标本检测233份,脾脏标本检测226份,肾脏标本检测234份,任一组织阳性判定为阳性。结果显示,伯氏疏螺旋体、问号钩端螺旋体和巴贝虫检出率分别为17.45%(41/235)、3.40%(8/235)和0.85%(1/235),莫氏立克次体、恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体和土拉弗朗西斯菌未检出,不同病原体检出率差异有统计学意义(χ2=200.54,P<0.001)。

2.3 不同小兽病原体分布情况

伯氏疏螺旋体在长尾仓鼠、大林姬鼠、高原鼠兔、小家鼠、子午沙鼠、普通田鼠、仓鼠、间颅鼠兔、五趾跳鼠等9种41只小型兽类中检出,检出率以五趾跳鼠最高(66.67%),其次为普通田鼠(50.00%)和大林姬鼠(29.17%),见表2。不同小型兽类间伯氏疏螺旋体的检出率差异有统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.038),伯氏疏螺旋体在肝、脾、肾3种组织中的检出率差异无统计学意义(8.58% vs 10.62% vs 10.68%,χ2=0.739,P=0.700)。问号钩端螺旋体在长尾仓鼠、小家鼠、普通田鼠和根田鼠中检出,在不同小型兽类间的检出率差异有统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.004),在肝、脾、肾3种组织中的检出率差异无统计学意义(2.15% vs 1.33% vs 2.14%,Fisher确切概率法,P=0.828)。巴贝虫仅在1只香鼬中检出,检出率为0.43%(1/235)。此外3只普通田鼠、2只长尾仓鼠中存在伯氏疏螺旋体和问号钩端螺旋体混合感染的情况,混合感染率为2.13%(5/235)。

表2 青海高原地区小型兽类伯氏疏螺旋体和问号钩端螺旋体检出情况(%)

Table 2 Detection of Borrelia burgdor feri and Leptospira interrogans in different small mammals in the Qinghai plateau region (%)

注:括号内数据为阳性数/检测数,括号外数据为百分比(%)。

2.4 不同生境病原体分布情况

5种生境中的小型兽类均有病原体的检出,其中林区的阳性率最高,为33.90%(20/59),其次是农田17.98%(16/89),草场最低,不同生境间的检出率差异有统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.008)。伯氏疏螺旋体在农田、林区、草场、半沙漠地和灌木丛5种生境均有检出,不同生境间的检出率差异有统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.024);仅在农田和林区2种生境检出问号钩端螺旋体,各生境间的检出率差异无统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.345);巴贝虫仅在林区小型兽类中检出,携带率为1.69%(1/59),见表3。

表3 青海高原地区不同生境小型兽类多种病原体检出情况(%)

Tab.3 Detection of pathogens in small mammals in different habitats in the Qinghai plateau region (%)

生境捕获数(只) 感染情况病原体检出情况伯氏疏螺旋体问号钩端螺旋体巴贝虫农田 89 17.98(16/89) 15.73(14/89) 4.49(4/89) 0.00(0/89) 林区 59 33.90(20/59) 30.51(18/59) 6.78(4/59) 1.69(1/59) 草场 47 6.38(3/47) 6.38(3/47) 0.00(0/47) 0.00(0/47) 半沙漠地 26 15.38(4/26) 15.38(4/26) 0.00(0/26) 0.00(0/26) 灌木丛 14 14.29(2/14) 14.29(2/14) 0.00(0/14) 0.00(0/14) 注:括号内数据为阳性数/检测数,括号外数据为百分比(%)。

2.5 巴贝虫核苷酸系统进化分析

从1只香鼬的肝、脾组织中获得了2条488 bp的巴贝虫18S rRNA核苷酸序列(OR492594-OR492595),经过BLAST比对,这两条序列均与从獾中分离出的Babesia sp. voucher(MK742772) 和Babesia sp. badger type A(MG799845)的18S rRNA序列具有较高的一致性,达到98.77%。巴贝虫18S rRNA基因序列系统发育分析显示,本研究中得到的2条序列与Babesia vulpes聚为一簇,但这2条序列又聚为一个独立的分支,提示与已报道的巴贝虫序列存在一定差异(图1)。

图1 基于18S rRNA基因构建巴贝虫系统进化树
注:圆点代表本研究中测得的巴贝虫序列。

Fig.1 Phylogenetic tree constructed on the basis of the 18S rRNA gene sequences of Babesia sp.

Full size|PPT slide

3 讨论

本次调查所捕获的235只小型兽类以长尾仓鼠、大林姬鼠、高原鼠兔、小家鼠、毛足鼠和子午沙鼠为主,与2011-2018年青海柴达木盆地报道的小型兽类分布情况略有不同,本次调查捕获有啮齿目中的普通田鼠及林跳鼠和兔形目中的间颅鼠兔是柴达木盆地没有报道的,这可能与不同调查地、不同生境选择有关[3,9]。伯氏疏螺旋体、问号钩端螺旋体、巴贝虫这3种病原体在当地小型兽类中有检出,其他4种病原体未检出,且不同病原体在小型兽类中的检出率差异有统计学意义,这提示了不同小型兽类中鼠传病原体的感染情况有所不同,表现出一定的宿主特异性。伯氏疏螺旋体感染率是17.45%,高于新疆北疆鼠类(8.84%)和粤东丰溪自然保护区白腹巨鼠、褐家鼠体感染率(3.77%)[10,11],低于青海省林区长尾仓鼠、小家鼠等感染率(20.59%)[12];在五趾跳鼠、普通田鼠、大林姬鼠、长尾仓鼠、小家鼠等11种小兽中检出,是当地流行较广泛的鼠传疾病病原体之一。问号钩端螺旋体在长尾仓鼠、普通田鼠、小家鼠和根田鼠等4 种啮齿动物检出,总体感染率是3.40%,低于北京城郊区小家鼠、褐家鼠、朝鲜姬鼠等感染率(18.7%)和湖州城郊褐家鼠、黄胸鼠、黑线姬鼠等感染率(7.62%)[13,14]。且有5只小兽存在伯氏疏螺旋体和问号钩端螺旋体混合感染现象,这可能会增加病原体的传播概率,增大人群患病风险[15,16]。此外,本研究分别采用了肝脏、脾脏和肾脏3种组织进行病原体检测,伯氏疏螺旋体在肝脏、脾脏、肾脏阳性标本数仅为总阳性标本数的48.78%、58.54%和60.98%,问号钩端螺旋体在肝脏、脾脏、肾脏阳性标本数仅为总阳性标本数的62.5%、37.5%和62.5%,单一脏器标本阳性结果不高,易造成漏检,建议在检测中使用多脏器标本重复检测,以提高准确率。

在香鼬中检测到巴贝虫,18S rRNA基因序列分析显示为B. vulpes。巴贝虫是一类寄生于患者红细胞内的原虫寄生虫,常通过硬蜱、受污染的血液制品和垂直传播,在狐、獾等野生动物和犬、牛、马等家畜中存在,引起巴贝虫病,作为新兴的人兽共患病病原体受到越来越多的关注。巴贝虫病可表现为慢性无症状,或急性的发热、溶血、黄疸、乏力、嗜睡和厌食等,并发呼吸衰竭、弥散性血管内凝血和/或器官功能衰竭[17]。迄今为止,我国黑龙江、云南、内蒙古、浙江等地已报道人类巴贝虫感染的病例[18]。巴贝虫属种类繁多,其中Babesia vulpes在西班牙牛中初次报道(当时被称为Theileria annae),在意大利、土耳其、德国等欧洲赤狐中也有检出[19,20];2019年对北美9 376只狗进行了巴贝虫物种评估,结果显示,B.vulpes也是经常被感染的物种[21];2021年在中国红狐、亚洲獾及其蜱中发现[22]。本次为首次在香鼬中发现B.vulpes,这一发现丰富了我们对B.vulpes潜在传播媒介和分布范围的认识。

受青海省天气、动物密度、现场工作适宜条件等客观因素限制,我们选择在6-8月集中开展野外采集工作,但此方法存在一定局限性,可能无法监测到小型兽类携带病原体的动态变化情况。本研究监测采样重点生境为农田、林区、高山草原、半沙漠地和灌木丛,调查的小型兽类主要存在于与人居环境较密切的农田、林区等生境,灌木丛、半沙漠生境中小兽数量很少,但是伯氏疏螺旋体感染率却很高。青海省的旅游业多为自然景观,游客参观旅游时在外界容易和小型兽类接触,使患病几率提升,对公共卫生安全造成了极大的威胁,因此,要持续监测与人居环境较近的生境外,也应加强高山草原和灌木丛生境中小型兽类病原体的监测[23]。

综上所述,本次调查选取了7种人兽共患病病原体,分析了青海高原地区小型兽类7种人兽共患病病原谱和基本流行规律,调查发现伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体和巴贝虫在当地小型兽类有感染,对于当地人群具有一定致病风险。因此,应深入开展不同病原体、动物宿主和传播媒介等病原学方面的研究,为有效预防和控制人兽共患病疾病提供科学依据。

利益冲突: 无

引用本文格式: 程红兵,刘益萍,崔佳,等.青海高原地区小型兽类7种病原体携带情况调查研究[J].中国人兽共患病学报,2024,40(9):880-886. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.131

编辑:张智芳

=2" class="main_content_center_left_zhengwen_bao_erji_title main_content_center_left_one_title" style="font-size: 16px;">{{custom_sec.title}}{{custom_sec.content}}