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一种山乌龟的离体快速繁殖方法.pdf

来源：花匠小妙招时间：2024-12-21 08:08

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1、10申请公布号CN102017894A43申请公布日20110420CN102017894ACN102017894A21申请号201010508270522申请日20101015A01H4/0020060171申请人云南省农业科学院花卉研究所地址650205云南省昆明市北郊龙头街云南省农业科学院内72发明人单芹丽杨春梅屈云慧赵培飞汪国鲜74专利代理机构昆明正原专利代理有限责任公司53100代理人徐玲菊54发明名称一种山乌龟的离体快速繁殖方法57摘要本发明提供一种山乌龟的离体快速繁殖方法，经过外植体的选择、外植体灭菌、不定芽诱导培养、不定芽增殖培养、继代培养、生根培养、过渡移栽等工艺步骤，在所对。

2、应的各种培养基上进行培养，炼苗后直接移栽即可。进种率可达90，移栽成活率在85以上。该方法解决了山乌龟用常规方法繁殖能力差，繁殖速度慢的难题，建立了山乌龟无菌繁殖技术体系。达到了进种效率高，增殖速度快的目的。实现了山乌龟优良品种种苗的规模化和标准化生产。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页CN102017906A1/2页21一种山乌龟的离体快速繁殖方法，其特征在于经过以下工艺步骤A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成23CM长的茎段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗茎。

3、段，再用清水洗净，用质量浓度为01的升汞溶液消毒14MIN，用无菌水漂洗34次，得无菌茎段；B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中MS培养基6苄胺基嘌呤6BA0510MG/L2，4二氯苯氧乙酸2，4D0005MG/L萘乙酸NAA0005MG/L琼脂65G/L白糖30G/LPH值5860在培养温度为2228，光照强度为15002000LX，光照时间为812H/D的条件下，诱导培养1630天，在茎段基部萌发出14个不定芽；C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中MS培养基6苄胺基嘌呤6BA1020MG/L2，4二氯苯氧乙酸2，4D002004MG/L萘乙酸NAA002004MG/L琼脂。

4、65G/L白糖30G/LPH值5860在培养温度为2228，光照强度为20002500LX，光照时间为812H/D的条件下，增殖培养2025天，每个不定芽新增殖19个增殖芽，切下新增的高度为25CM的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；D、将C步骤的增殖芽按节切成23CM长的茎段，接种在下列继代培养中3吲哚丁酸IBA0103MG/L萘乙酸NAA0103MG/L琼脂65G/L白糖30G/LPH值5860在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中1/。

5、2MS培养基6苄胺基嘌呤6BA002MG/L3吲哚丁酸IBA010MG/L萘乙酸NAA010MG/L权利要求书CN102017894ACN102017906A2/2页3琼脂70G/L白糖30G/LPH值5860在培养温度为2228，光照强度为20002500LX，光照时间为812H/D的条件下，培养1520天，得生根苗；F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼57天，取苗，用清水洗净苗上培养基，放入01多菌灵溶液中消毒12分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩111质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防治管理，成活率达85以上，当苗长至35CM高，并生出大量须根时，。

6、即得到种植苗。权利要求书CN102017894ACN102017906A1/8页4一种山乌龟的离体快速繁殖方法技术领域0001本发明涉及一种植物快速繁殖方法，尤其是山乌龟的离体快速繁殖方法，属于植物栽培技术领域。背景技术0002山乌龟是我国传统中药，主要分布于我国云南、贵州、四川等地。由于其肉质块根古雅、奇特，果实玲珑，叶色清秀，植株外形别致可爱，因此，除了用作药材外，还可作为极具观赏价值的盆栽植物，或者园林、绿化用植物。山乌龟植物最具药用价值的是其硕大的根块，其成分中富含生物碱，随着新分离技术和高灵敏检测仪器的出现，大量的生物碱被分离出来，含量高达34，在临床上被广泛用于抗菌消炎、镇静、理气。

7、止痛等，同时山乌龟根块是颅痛定的主要生产原料。随着山乌龟的药用价值和观赏价值被不断发掘，市场对山乌龟的需求时也逐渐加大。然而由于山乌龟为雌雄异株，且种子小，种壳坚硬，在自然条件下萌发较为困难，因此繁殖能力极差，加上近年来受人为造成的环境因素影响，使山乌龟的种群及个体数量急剧减少。仅通过传统的播种、分块的方法，远不能满足日益增长的市场需求。因此，需要研发出新的成本低、时间短、成活率高的无性繁殖体系，以扩大山乌龟繁殖量，实现山乌龟的产业化生产。发明内容0003本发明的目的在于提供一种山乌龟的组织培养与快速繁殖方法，以建立山乌龟种群，扩大山乌龟繁殖量，提高增殖率及生根率，为山乌龟的规模化、产业化生产。

8、提供优质种苗。0004为实现上述目的，本发明提供这样一种山乌龟的离体快速繁殖方法，其特征在于经过以下工艺步骤0005A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成23CM长的茎段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为01的升汞溶液消毒14MIN，用无菌水漂洗34次，得无菌茎段；0006B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中0007MS培养基00086苄胺基嘌呤6BA0510MG/L00092，4二氯苯氧乙酸2，4D0005MG/L0010萘乙酸NAA0005MG/L0011琼脂65G/L00。

9、12白糖30G/L0013PH值58600014在培养温度为2228，光照强度为15002000LX，光照时间为812H/D说明书CN102017894ACN102017906A2/8页5的条件下，诱导培养1630天，在茎段基部萌发出14个不定芽；0015C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中0016MS培养基00176苄胺基嘌呤6BA1020MG/L00182，4二氯苯氧乙酸2，4D002004MG/L0019萘乙酸NAA002004MG/L0020琼脂65G/L0021白糖30G/L0022PH值58600023在培养温度为2228，光照强度为20002500LX，光照时间为812。

10、H/D的条件下，增殖培养2025天，每个不定芽新增殖19个增殖芽，切下新增的高度为25CM的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；0024D、将C步骤的增殖芽按节切成23CM长的茎段，接种在下列继代培养中00253吲哚丁酸IBA0103MG/L0026萘乙酸NAA0103MG/L0027琼脂65G/L0028白糖30G/L0029PH值58600030在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；0031E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中00321/2MS培养基00336苄胺基嘌呤6B。

11、A002MG/L00343吲哚丁酸IBA010MG/L0035萘乙酸NAA010MG/L0036琼脂70G/L0037白糖30G/L0038PH值58600039在培养温度为2228，光照强度为20002500LX，光照时间为812H/D的条件下，培养1520天，得生根苗；0040F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼57天，取苗，用清水洗净苗上培养基，放入01多菌灵溶液中消毒12分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩111质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防治管理，成活率达85以上，当苗长至35CM高，并生出大量须根时，即得到种植苗。0041本发明具有下列优点。

12、和效果00421、采用上述方案，可对山乌龟的茎段进行快速增殖，同时保持和固定了山乌龟块根硕大、高产、形状奇特等优良种性，从而在保证药用需求的同时，又能满足观赏价值的特殊需求；说明书CN102017894ACN102017906A3/8页600432、种苗来源单一，易于控制，解决了常规种子繁育体系很难将山乌龟优良性状固定或保持下来的难题，有效地提高了种苗质量；00443、能有效缩短生产周期，繁殖速度快，2025D为一个周期，繁殖倍数达19，易于优质种苗的规模化、标准化和工厂化生产；00454、利用组织培养技术在培养室内实现周年生产，节约了土地资源，提高了经济效益，克服了种苗无法周年进行生产的难点。

13、；00465、本发明对山乌龟种苗生产技术流程中的关键环节进行优化整合，采取低激素配比、激素混用和轮用的方式，达到提高增殖率和减少变异的目的，所生产的增殖苗和生根苗，苗株健壮、节间短而粗壮、叶色浓绿，质量优，移栽成活率高达85以上；00476、无菌生根苗直接移栽进入育苗袋中，省去了组培苗营养钵移栽的环节，移栽成活的种苗便于运输，摘去育苗袋后即可直接栽种。具体实施方式0048为了更好地说明本发明的实质内容，下面结合本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于这些。0049实施例10050A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切。

14、成23CM长的茎段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为01的升汞溶液消毒1MIN，用无菌水漂洗3次，得无菌茎段；0051B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中0052MS培养基00536苄胺基嘌呤6BA05MG/L0054琼脂65G/L0055白糖30G/L0056PH值580057在培养温度为22，光照强度为1500LX，光照时间为12H/D的条件下，诱导培养16天，在茎段基部萌发出个不定芽，最少的发出一个芽，最多的发出四个芽；0058C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中0059MS培养基00606苄胺基嘌呤6BA10MG/L00612，4二氯苯氧。

15、乙酸2，4D002MG/L0062萘乙酸NAA002MG/L0063琼脂65G/L0064白糖30G/L0065PH值580066在培养温度为22，光照强度为2000LX，光照时间为12H/D的条件下，增殖培养20天，每个不定芽又新增出增殖芽，最少的增殖一个芽，最多的增殖九个芽，切下新增的高度为25CM的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同说明书CN102017894ACN102017906A4/8页7的培养条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；0067D、将C步骤的增殖芽按节切成23CM长的茎段，接种在下列继代培养基中00683吲哚丁酸IBA01MG/L0。

16、069萘乙酸NAA01MG/L0070琼脂65G/L0071白糖30G/L0072PH值580073在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；0074E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下长23CM的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为00751/2MS培养基0076琼脂70G/L0077白糖30G/L0078PH值580079在培养温度为22，光照强度为2000LX，光照时间为12H/D的条件下，培养15天，得生根苗；0080F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼5天，取苗。

17、，用清水洗净苗上培养基，放入01多菌灵溶液中消毒1分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩111质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防治管理，成活率达85以上，当苗长至35CM高，并生出大量须根时，即得到直接种植在大田中的种植苗。0081实施例20082A、选择体积硕大、形状优美特别、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成23CM长的茎段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为01的升汞溶液消毒4MIN，用无菌水漂洗4次，得无菌茎段；0083B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中008。

18、4MS培养基00856苄胺基嘌呤6BA10MG/L00862，4二氯苯氧乙酸2，4D005MG/L0087萘乙酸NAA005MG/L0088琼脂65G/L0089白糖30G/L0090PH值600091在培养温度为28，光照强度为2000LX，光照时间为8H/D的条件下，诱导培养30天，在茎段基部萌发出不定芽，最少的一个芽，最多的四个芽；0092C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中0093MS培养基说明书CN102017894ACN102017906A5/8页800946苄胺基嘌呤6BA20MG/L00952，4二氯苯氧乙酸2，4D004MG/L0096萘乙酸NAA004MG/L00。

19、97琼脂65G/L0098白糖30G/L0099PH值600100在培养温度为28，光照强度为2500LX，光照时间为8H/D的条件下，增殖培养25天，每个不定芽新增出增殖芽，最少的一个芽，最多的九个芽，切下新增的高度为25CM的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；0101D、将C步骤的增殖芽按节切成23CM长的茎段，接种在下列继代培养中01023吲哚丁酸IBA03MG/L0103萘乙酸NAA03MG/L0104琼脂65G/L0105白糖30G/L0106PH值600107在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得。

20、健壮、带叶的丛生苗；0108E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下长23CM的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为01091/2MS培养基01106苄胺基嘌呤6BA02MG/L01113吲哚丁酸IBA10MG/L0112萘乙酸NAA10MG/L0113琼脂70G/L0114白糖30G/L0115PH值600116在培养温度为28，光照强度为2500LX，光照时间为8H/D的条件下，培养20天，得生根苗；0117F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼7天，取苗，用清水洗净苗上培养基，放入01多菌灵。

21、溶液中消毒2分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩111质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防治管理，成活率达85以上，当苗长至35CM高，并生出大量须根时，即得到直接种植在大田中的种植苗。0118实施例30119A、选择体积硕大、形状优美奇特、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成23CM长的茎段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为01的升汞溶液消毒2MIN，用无菌水漂洗3次，得无菌茎段；说明书CN102017894ACN102017906A6/8页90120B、将A步骤的无菌茎段接。

22、种于下列诱导培养基中0121MS培养基01226苄胺基嘌呤6BA08MG/L0123萘乙酸NAA003MG/L0124琼脂65G/L0125白糖30G/L0126PH值590127在培养温度为25，光照强度为1800LX，光照时间为10H/D的条件下，诱导培养22天，在茎段基部萌发出不定芽，少的为一个芽，多的为四个芽；0128C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中0129MS培养基01306苄胺基嘌呤6BA15MG/L01312，4二氯苯氧乙酸2，4D003MG/L0132萘乙酸NAA003MG/L0133琼脂65G/L0134白糖30G/L0135PH值590136在培养温度为25，。

23、光照强度为2200LX，光照时间为10H/D的条件下，增殖培养22天，每个不定芽新增出增殖芽。最少的为一个芽，最多的为九个芽，切下新增的高度为25CM的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；0137D、将C步骤的增殖芽按节切成23CM长的茎段，接种在下列继代培养中01383吲哚丁酸IBA02MG/L0139萘乙酸NAA02MG/L0140琼脂65G/L0141白糖30G/L0142PH值590143在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；0144E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中。

24、，芽苗过高的，可切下长23CM的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为01451/2MS培养基01466苄胺基嘌呤6BA01MG/L01473吲哚丁酸IBA05MG/L0148琼脂70G/L0149白糖30G/L0150PH值590151在培养温度为25，光照强度为2300LX，光照时间为10H/D的条件下，培养18天，得生根苗；说明书CN102017894ACN102017906A7/8页100152F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼6天，取苗，用清水洗净苗上培养基，放入01多菌灵溶液中消毒1分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩。

25、111质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防治管理，成活率达85以上，当苗长至35CM高，并生出大量须根时，即得到直接种植在大田中的种植苗。0153实施例40154A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成23CM长的茎段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为01的升汞溶液消毒3MIN，用无菌水漂洗4次，得无菌茎段；0155B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中0156MS培养基01576苄胺基嘌呤6BA06MG/L01582，4二氯苯氧乙酸2，4D。

26、002MG/L0159琼脂65G/L0160白糖30G/L0161PH值580162在培养温度为26，光照强度为1800LX，光照时间为9H/D的条件下，诱导培养20天，在茎段基部萌发出不定芽，最少的一个芽，最多的四个芽；0163C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中0164MS培养基01656苄胺基嘌呤6BA20MG/L01662，4二氯苯氧乙酸2，4D002MG/L0167萘乙酸NAA004MG/L0168琼脂65G/L0169白糖30G/L0170PH值580171在培养温度为26，光照强度为2300LX，光照时间为9H/D的条件下，增殖培养23天，每个不定芽新增出增殖芽，最少的。

27、一个芽，最多的九个芽，切下新增的高度为25CM的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；0172D、将C步骤的增殖芽按节切成23CM长的茎段，接种在下列继代培养中01733吲哚丁酸IBA01MG/L0174萘乙酸NAA03MG/L0175琼脂65G/L0176白糖30G/L0177PH值580178在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；0179E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下说明书CN102017894ACN102017906A8/8页11长23CM的苗尖转。

28、接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为01801/2MS培养基0181萘乙酸NAA10MG/L0182琼脂70G/L0183白糖30G/L0184PH值580185在培养温度为26，光照强度为2300LX，光照时间为9H/D的条件下，培养18天，得生根苗；0186F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼6天，取苗，用清水洗净苗上培养基，放入01多菌灵溶液中消毒2分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩111质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防治管理，成活率达85以上，当苗长至35CM高，并生出大量须根时，即得到直接种植在大田中的种植苗。说明书CN102017894A。