首页分享跟着这篇文章，小白也能快速上手高分转录多组学分析套路

跟着这篇文章，小白也能快速上手高分转录多组学分析套路

来源：花匠小妙招时间：2024-12-19 00:20

季节性开花的墨兰产生腋生花分生组织，在寒冷的条件下需要休眠期以促进花的发育。然而，它们的芽激活机制尚不清楚。2024年3月12日，广东省农科院在Horticulture Research在线发表了题为“Integrated proteomic, transcriptomic and metabolomic profiling reveals that GA-ABA hub runs the flower development in Chinese orchid Cymbidium sinense”的研究论文。该研究通过转录组，蛋白质组，代谢组以及核心基因的功能分析，揭示了中国墨兰花芽形成和生长的内在机制。

研究结果

1.墨兰的开花生理及间断性花发育

墨兰的花发育分为4个阶段，7月，花的发育开始于茎侧的花支脉的出现，形成花原基(图1A, B)，这是第一阶段。第二阶段持续3-4个月。花序伸长非常缓慢，保持在5cm以下(图1F, G)。萼片伸长迅速，形成细条，比其他花器官长。花瓣的长度与唇瓣相当，紧紧地贴在花柱上。花药逐渐变大成熟，但柱体生长速度缓慢。S3期花发育加快，花茎伸长，花序和花从苞片中出。在这个阶段花瓣和唇的长度超过了花柱。S4期，1月中旬，花器官发育成熟，裂片展开，花柱不断弯曲。整朵花在一周后生长开花。与连续开花品种相比，季节性开花品种的唇部和柱部发育处于暂停状态。此外，唇瓣在休眠阶段不发育，说明控制花瓣和唇瓣发育的基因不同，花器官的分化和发育不同步。

图1 墨兰花的完整发育过程和不同发育阶段的季节性分布。

2.多组学数据分析

为了揭示墨兰独特的间歇性花器官发育模式的调控网络，作者进行了转录组和蛋白质组分析。通过比较转录组和蛋白质组数据，我们确定了同时存在于转录组和蛋白质组水平的 6,977 个基因（图 2A）。对不同发育阶段（0-5）的基因在转录和翻译水平上的潜在关系进行了探索（图 2B）。这些蛋白质或转录本被分为 6 类。在前三个聚类（1- 3）中，基因主要在花发育早期上调，而在花发育晚期下调（图 2B）。与此相反，第 4-6 个群组中的基因在花发育早期普遍呈下调趋势，而在花发育晚期呈上调趋势。KEGG富集分析发现，剪接体(pda03040)、次生代谢物生物合成(pda01110)、碳代谢(pda01200)和核糖体(pda03040)通路富集(图2D)。

图2 转录组与蛋白质组分析概述

3. 加权基因共表达网络分析(WGCNA)及花发育的核心调控因子

选择5553个基因进行模块构建。共构建了10个花期和花期发育模块。其中MEturquoise含有高度相关的基因(图4A)，其次是MEblue。MEbrown包含最多花期调控下调基因，花发育调控上调基因最多。MEturquoise的基因在花发育的早期阶段表达显著(图4D)，尤其是FD1。MEblue，FD0的基因表达量最高(图4E)。MEbrown基因在早期主要下调(图4F)，而在快速生长的FD4和FD5中高表达，这表明花的发育可能独立于开花时间的调节。从三个关键模块中，分离出了在开花时间调控和花发育中起重要作用的必需基因(图4 G-I)。对每个模块构建网络图。从MEturquoise模块中共选择了12个早期表达上调、晚期表达下调的基因(图4J)。这些基因主要与激素和花期调控有关，包括花时调控因子FCA和FY、花同源异体蛋白AP1和生长素转运蛋白BIG，在FD1特异性表达。来自MEblue的5个基因在早期也表现出高表达(图4K)。这些基因在花期调控因子FPA和生长素、细胞分裂素、ABA等激素调控因子中表达量最高。来自MEbrown的7个基因在花发育后期比早期表达量高(图4L)。生长调节因子(GRF1)与生长素(PIN3A)、细胞分裂素(CISZOG1)和赤霉素(KAO1)调控因子在FD5中特异性表达，其次是FD4和FD3。

图5加权基因共表达网络分析与枢纽基因鉴定。

通过个体挖掘，分离出 78 个潜在基因及其相应的蛋白质。这些基因与花的时间和发育以及激素调节因子有关，包括 ABA、GA、Auxin、细胞分裂素、糙叶内酯和乙烯。这些基因在花调节途径中具有潜在的作用。对这些基因进行基于 WGCNA 的相关性分析表明，所有花卉通路调节因子都相互关联。这表明在墨兰的花期和花发育调控过程中，来自不同途径的整合因子高度融合。在早期阶段，大多数基因与花期和分生组织决定性有关，而在晚期阶段，有激素调节因子。

图5 主要激素的代谢组分析

代谢组分析

代谢组鉴定出69种与主要植物激素相关的潜在化学物质(图5)。细胞分裂素最多(26种)，其次是生长素(20种)、赤霉素(9种)和茉莉酸(8种)。细胞分裂素主要在花发育的中期活跃(S1-S3)。赤霉素(GAs)在花发育的早期和后期保持明显的浓度梯度。大部分活性气体在休眠释放后的后期浓度较高，只有2种非活性气体在花发育的早期休眠阶段浓度较高。相反，ABA在休眠阶段含量较高，在后期保持较低水平。

4. GA和ABA信号是花发育的关键因子

分离了 20 个 ABA 和 GA 的潜在调控因子，包括 11 个 ABA 相关转录本和 9 个 GA 相关转录本以及相对应蛋白。与花的早期阶段相比，GA 调控基因的转录本水平在花的后期阶段相当高（图 6A）。与此相一致，代谢组数据也证实，除了早期的一些非活性 GAs 外，大多数 GAs 在花发育晚期含量较高（图 6C）。大部分非活性 GA 在花发育早期含量较高（图 6 C、D），而活性 GA 在晚期含量较高。休眠期活性 GA4 的含量很低，而非活性 GA53 的含量很高（图 6E、F）。因此，在休眠的前两个阶段，GA53 无法转化为活性 GA4，而这一过程中的关键基因非常重要。有趣的是，与 GA53 一样，ABA 水平在休眠早期也很高（图 6G）。

图6 基于多组学的主要赤霉素及其途径酶分析

基于代谢组数据，使用6种显著差异的GAs (GA1、GA4、GA9、GA19、GA20和GA53)和ABA来推断它们与转录组数据的相关性(图7A)。发现两个高度显著的模块MEyellow和MEred与GA4/GA1和GA53/GA19的相反作用高度一致。从MEyellow中，鉴定出了14个与GA、生长素、糖、细胞周期和ABA相关的枢纽基因(图7B)。同样，来自MEred模块的网络显示，GA调控基因(GASA1)位于中心，连接由生长素、细胞分裂素、糖和开花时间调控基因组成的亚网络(图7C)。在这两个模块中，大多数枢纽基因在花发育后期表达较高(图7D)。

图7基于wgna的赤霉素与ABA相关性分析及枢纽基因鉴定

5. 外源赤霉素触发花相关基因，促进花发育

外源施用GA显著促进了芽伸长。GA显著增加了花发育相关基因(CsSTK和CsAG)、赤霉素生物合成基因(CsGA2ox2和CsGA2ox8)和信号传导基因(CsSCL8)以及生长素途径基因(包括CsAUX、ARFs和csbzip)的表达(图8B）。

图8 花发育和开花途径基因对外源GA施用的影响。

6. ABA抑制花发育

外源ABA的施用抑制了芽的生长。施用ABA抑制剂后，花枝伸长明显提前。为了揭示ABA对花芽发育的调控作用，比较了ABA添加及其抑制剂处理前后花芽的转录组，并筛选了差异表达基因。其中，与花发育和/或激素信号相关的CsAP1及其共表达基因的差异表达变化最为显著。外源ABA处理花芽，观察cap1的反应。表达量在处理后4小时先下降，5小时后显著升高，12小时后再次下降(图9B)。对cap1的亚细胞定位分析显示，在细胞膜和细胞核内有亮信号(图9C)。拟南芥中过表达了CsAP1，发现 CsAP1 影响了花器官形态和花序结构（图 9D）。检测了与开花和花发育相关的几个关键调节基因的表达，发现这些基因的表达量显著增加。在墨兰原生质体中短暂过表达CsAP1(图9F, G)，并观察到72 h前的显著高表达(图9H)。CsAP1在墨兰中过表达可诱导下游开花相关基因SEP1、SEP4、AGL6、AP3-2、AP3-3和AP3-4(图9I)。转录组数据也支持了CsAP1和ABA之间的互惠关系(图9J)。从大量的花和激素调节因子来看，在花发育的不同阶段，CsAP1的表达与GA一致，而与ABA相反。因此，提出了ABA信号通路介导的花发育分子调控模型(图9K)。在正常情况下，ABA可以通过其应答元件ABRE对抗CsAP1的作用，最终影响ABCDE模型中花同源基因(包括sep、AGL6和AP3s)的功能。而ABA抑制剂则能释放ABA的抑制作用，打破墨兰芽半内休眠状态(图9K)。

图9 ABA与AP1在花芽发生发育调控中的关系

研究结论

转录组和蛋白质组分析鉴定出10个在花芽休眠和激活中起重要作用的模块。花发育早期的基因簇主要与开花时间调控和分生组织决定有关，而后期的基因簇则与激素信号通路相关。代谢组鉴定出69种潜在的激素，其中GA和ABA是主要的调节枢纽。外源施用GA可使花芽快速伸长，促进花发育基因的表达。相反，外源ABA延长了休眠过程，ABA抑制剂促进了休眠的释放。此外，csaptala1 (CsAP1)是ABA激活花芽的潜在靶点。cap1在拟南芥中的转化及其在墨兰原生质体中的瞬时过表达调控了开花和激素调控基因的表达。在CsAP1启动子中存在ABA响应元件，外源ABA处理后CsAP1快速下调，以及ABA抑制剂处理后花芽激活，说明ABA可以通过CsAP1控制芽的生长。

迈维代谢现推出全栈式·真贯穿方案，引领未来科研！，助力您的文章发表，欢迎扫码预约！

责任编辑：