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植物组织石蜡切片的制备与染色观察.docx 免费在线阅读

来源：花匠小妙招时间：2024-12-17 22:44

植物组织石蜡切片的制备与染色观察 1．实验器具与试剂 1.器具小培养皿、锡箔纸、尖头和平头镊子、剪刀、刀片、吸水纸、移液枪、1ml 枪头、移液器和移液管、量筒（50mL，100mL，250mL，500mL ）、废液瓶、水浴锅、酒精灯、三角瓶、真空锅、烘片箱、木筷、石蜡切片机、染色缸、载玻片、盖玻片、显微镜等 2.试剂 100%酒精、100%二甲苯、100%叔丁醇、石蜡块、蒸馏水、多聚甲醛、中性树胶、甲苯胺蓝（TB）染色剂等二. 实验步骤 1.溶液配制 10×PBS 溶液： NaCl（国药或生工） Na2HPO4.12H2O（国药） NaH2PO4.2H2O （国药） 75.95g 25.07g 4.68g 充分溶解后，用 NaOH（国药）调 PH7.0，定容 1000mL，高压灭菌 25min，4℃ 保存。 4%多聚甲醛固定液： 1× PBS 100mL 1M/L NaOH 0.5mL 水浴加热至 60-70℃，在通风橱中加入 4g 多聚甲醛，待溶解后冷却至 4℃，加入 100μl 的 10%的浓硫酸调节 pH 为 7.0。 2.材料准备 ⑴ 固定取幼嫩的植物材料，将植物组织剪成合适大小的小块，立即放入一个装有新配制的 4%多聚甲醛固定液的小器皿中，固定液体积视材料多少而定，一般材料少时 10ml 材料较多时可放 15ml，小器皿置于冰上。上面用锡箔纸盖好后扎孔。抽真空使得材料浸没其中（反复真空和非真空状态，并保固定液不要沸腾），待材料下沉到管底。具体操作如下：放置在冰上的器皿放入真空锅里，盖上锅盖，拧开盖上螺旋，拧紧侧面螺旋，打开开关当压力表上显示到 0.2 时可计时 10 分钟。关上锅盖螺旋，拧松侧面螺旋，外面空气会进入真空锅内，当内外压力相等时计时 10 分钟。再重复步骤①，换一次新的固定液，4℃过夜固定，但不要超过 16h。 (2) 漂洗用 1×PBS 缓冲液（PH 7.0）漂洗组织块 2 次，每次 4℃放置 30min。注意 PBS 容易结晶可 75℃水浴加热。 (3) 脱水在翻转下进行梯度乙醇和叔丁醇脱水：30%、40%、50%、60%、70%乙醇（此步可保存可过夜）、10%叔丁醇+20%水+70%乙醇、20%叔丁醇+10%水+70%乙醇、 30%叔丁醇+70%乙醇、50%叔丁醇+50 乙醇、70%叔丁醇+30%乙醇、90%叔丁醇 +10%乙醇、100%叔丁醇（2 次），30min/次。补充：若没有叔丁醇，可替换一下步骤进行 30%、40%、50%、60%、70%、80% 、95%、100%乙醇，然后 1/4 二甲苯+3/4 乙醇、1/2 二甲苯+1/2 乙醇、3/4 二甲苯+1/4 乙醇、100%二甲苯(2 次)，每步均 30 min。 (4) 浸蜡用刀片将石蜡块切成碎末，逐步加入到上述最后一步的材料中大约是 1/4 的量， 37℃烘箱过夜；继续加石蜡，同时放入到 42℃，待石蜡不继续熔化时放入到 60℃烘箱中，等待全部融化后，将叔丁醇和石蜡的混合物换成纯蜡，每天上午下午（9 点）各换纯蜡一次，持续 3 天。 (5) 包埋最后将材料包埋备用。在切片前将包埋块 4℃冰箱中保存，可保存至少一年。 3.组织切片 ⑴ 切片将包埋的材料用切片机进行组织学切片，切成 8μm 厚度的连续的薄片，用刀片把蜡片切成合适的长度（能放在载玻片上即可）。 ⑵ 展片和烘片转入 42℃的水中展片 2-3min，用氨基载玻片将其捞出，放置于 42℃过夜烘片（烘过的片子可以再放干燥剂的条件下保存数周。 ⑶ 脱蜡将烘过的片子浸没在 100%的二甲苯脱蜡两次，每次 15min； ⑷ 复水梯度乙醇复水：100%、95%、85%、70%、60%、30%、水两次，每步 3min。 ⑸ 染色 0.05% TB（甲苯胺蓝）染色 37℃,30 min。染色时间不要太久，中间可以拿出来看一下。然后把片子置于一个盛水的容器中，把片子浸入再提出，不要直接用水冲，直至水变清，拿出晾干。二甲苯：无水乙醇 =1：1 10 s 。 100%二甲苯 2min, 2 次。滴上 1—2 滴中性树胶（加拿大树胶）后盖上盖玻片（不要有气泡)。 ⑹ 镜检观察。