一种促进植物提前开花的火龙果HuNIP6;1基因及其应用

本发明涉及分子生物技术领域，更具体地，涉及一种促进植物提前开花的火龙果hunip6；1基因及其应用。

背景技术：

火龙果又称红龙果、仙蜜果、情人果等，为仙人掌科(cactaceae)量天尺属(hylocereus)或蛇鞭柱属(selenicereus)的栽培植物。火龙果作为一种具有很高营养价值和经济价值的新兴水果，自从将其改良引进我国后，深受广大消费者喜爱。火龙果花，又称剑花、霸王花、量天尺花等，为子房下位花，漏斗状，花长约35cm，开放时直径达25～30cm，花香浓郁，极具观赏价值。火龙果是晚上开花，天亮时花开始逐渐闭合、凋谢，是一种有昼夜节律的开花模式。为了提高火龙果产量和经济效益，在生产上通常会进行人工授粉，但这样也会使其生产成本增加。

开花是植物由营养生长转变为生殖生长的重要过程，是一个重要的农艺性状，它决定着植物是否适应于特定的栽培地区及生长季节。植物开花是植物从营养生长到生殖生长变化的关键。在外界环境和内在因子的影响下，植物会在适当的时机开花进而生殖生长。通过调节开花期，使植物延迟或提前开花，可以控制植物的营养生长或生殖生长，避免逆境对作物的伤害。在最适合的时期开花可以达到最大的效益，促进资源的积累、分配及有效利用，对提高作物产量意义重大。

水通道蛋白(aquaporin)是一种多功能的膜蛋白，在多个植物的生长发育过程中扮演着不可或缺的角色。水通道蛋白除了水分运输，还能实现一些小分子溶质、气体和金属离子的跨膜运输，同时参与叶片气孔运动、光合作用和植物开花过程，还可以有效抵御各种抗逆胁迫。aquaporin在火龙果开花中的作用还未见报道。因此，本领域有必要在火龙果开花模式中筛选具有促进植物提前开花的基因，进行植物品种改良，缩短蔬菜和水果的收成期，提高产量和经济效益，为丰富和平衡我国农作物市场提供种质资源。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种促进植物提前开花的火龙果hunip6；1基因及其应用。本发明为植物开花时间的调控提供了理论依据和技术手段，在生产上对促进植株提前开花有着广泛的应有前景，具有很大的应用的价值。

本发明的第一个目的是提供一种促进植物提前开花的火龙果hunip6；1基因。

本发明的第二个目的是提供一种促进植物提前开花的hunip6；1蛋白。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组工程菌。

本发明的第五个目的是提供所述hunip6；1基因、所述hunip6；1蛋白、所述重组载体或所述重组工程菌在促进植物提前开花中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种促进植物提前开花的方法。

本发明的第七个目的是提供一组用于扩增所述hunip6；1基因的引物。

本发明的第八个目的是提供一组用于鉴定所述hunip6；1基因的阳性转基因植株的引物。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明提供了一种促进植物提前开花的火龙果hunip6；1基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种促进植物提前开花的hunip6；1蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

优选地，所述促进植物提前开花的hunip6；1蛋白是由所述hunip6；1基因编码得到的。

本发明要求保护一种重组载体，含有所述hunip6；1基因。

以及要求保护一种重组工程菌，含有所述hunip6；1基因或所述重组载体。

所述hunip6；1基因、所述hunip6；1蛋白、所述重组载体或所述重组工程菌在促进植物提前开花中的应用，也属于本发明的保护范围之内。

优选地，所述应用为在植物中表达或过表达所述hunip6；1基因和/或权利要求2所述hunip6；1蛋白。

优选地，所述植物为十字花科植物。

本发明还要求保护一种促进植物提前开花的方法，将所述hunip6；1基因转化到植物中。

优选地，将所述重组载体或将所述重组工程菌转化到植物中进行表达或过表达所述hunip6；1基因。

更优选地，所述方法包括如下具体步骤：

s1.将hunip6；1基因构建到由35s驱动的表达载体上，获得重组载体。

s2.将步骤s1的重组载体转入工程菌中，获得重组工程菌。

s3.将步骤s3的重组工程菌转化到植物中。

更优选地，步骤s1所述表达载体为ppzp6k90。

更优选地，步骤s2所述工程菌为根癌农杆菌。

更优选地，所述植物为十字花科植物。

进一步优选地，所述植物为拟南芥。

本发明还要求保护：

一组用于扩增所述hunip6；1基因的引物，其核苷酸序列如seqidno.3～4所示。

一组用于鉴定所述hunip6；1基因的阳性转基因植株的引物，其核苷酸序列如seqidno.7～8所示。

所述序列具体如下：

seqidno.3：atggatgctgaggatcccgg；

seqidno.4：tcatctccggaagcttggtg；

seqidno.7：

cattctacaactacatctagaatggatgctgaggatcccgg；

seqidno.8：

agcttgcatgccaattctagatcatctccggaagcttggtg。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种促进植物提前开花的火龙果hunip6；1基因。本发明首次克隆出调控火龙果开花的hunip6；1基因，其是aquaporin基因家族的成员，长度为915bp，编码的氨基酸数目为304个。通过农杆菌介导的拟南芥遗传转化的方法，对上述调控植物开花的火龙果hunip6；1基因的功能进行了验证，发现异源表达该基因能够使转基因植株的开花时间明显早于野生型，说明其具有调控植物提早开花的功能。

因此，本发明为植物开花时间的调控提供了理论依据和技术手段，在生产上对促进植株提前开花有着广泛的应有前景，具有很大的应用的价值；利用该基因进行植物品种改良，能够缩短蔬菜或水果的收成期，提高产量和经济效益，为丰富和平衡我国农作物市场提供种质资源。

附图说明

图1为火龙果和其他物种aquaporin基因的进化树图。

图2为火龙果花总rna的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为hunip6；1基因克隆扩增的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为hunip6；1基因亚细胞定位图。

图5为转hunip6；1基因拟南芥的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图6为转hunip6；1基因拟南芥和野生型拟南芥的表型图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1火龙果夜间开花相关基因的筛选和克隆

1、火龙果夜间开花相关基因的筛选和聚类分析

在火龙果基因组数据库中采用“aquaporin”关键词共搜索到44条基因序列，排除不完整的mip结构域或不完整的npa基序后，最后筛选出1个结构完整的与火龙果夜间开花的相关基因hunip6；1。用tair(https://www.arabidopsis.org/)和ncbidatabase(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载用于构建进化树的aquaporin基因的氨基酸全长序列，采用最大似然法通过megax软件构建系统进化树bootstrap值(置展值)为1000次，进化树结果如图1所示。

2、hunip6；1基因的序列分析及氨基酸序列的理化性质

hunip6；1基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，hunip6；1基因的cdna全长为915bp，共编码304个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.2所示，等电点为6.07，蛋白质分子量为31.43kd，定位在火龙果的3号染色体上。

3、火龙果花样品总rna的提取和cdna第一条链的合成

采用easyspinplus植物rna快速提取试剂盒(rn38)(aidlab，china)对火龙果‘红冠1号’花的总rna进行提取(具体方法参照说明书)，取2μlrna溶液置于核酸测定仪上检测rna的浓度和纯度，并用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测其完整性，符合条件的样品用于下一步的实验。

琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，可以看出火龙果花的总rna呈现出清晰的28s和18s两条带，并且28s的亮度是18s的亮度的两倍左右，没有拖尾现象，说明无基因组dna污染，表明提取的总rna质量比较高，无明显降解，可以满足后续实验的需要。

条带符合要求后采用primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara，japan)反转录试剂盒将总rna反转录为cdna，具体操作参照说明书。cdna使用火龙果内参基因actin检测合格后-20℃保存备用。

4、hunip6；1基因的克隆

(1)hunip6；1基因的扩增和检测

以火龙果花的cdna为模板，利用特异性引物克隆hunip6；1，反应体系和反应步骤具体参照i-5tm2×high-fidelitymastermix(mclab,america)的说明书。根据hunip6；1基因的全长序列(seqidno.1)，用primerpremier5.0软件分别于其起始子和终止子处设计引物，引物序列如seqidno.3～4所示，引物由艾基生物工程(广州)有限公司合成。

seqidno.3：atggatgctgaggatcccgg；

seqidno.4：tcatctccggaagcttggtg。

扩增条件为：98℃、2min；98℃、10s，56℃、15s，72℃、5min，共35个循环；72℃、10min。反应结束后取2μl扩增产物进行凝胶电泳，检测pcr扩增产物是否正确。扩增结果如图3所示，在915bp处有明显的条带，说明pcr扩增产物正确。

(2)pcr产物的回收

将pcr扩增产物全部用于普通琼脂糖凝胶电泳，用手术刀在紫外灯下切胶，最后用starprep快速dna胶回收试剂盒进行回收，具体方法参见说明书。回收后取适量产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并在核酸测定仪上检测回收产物的纯度和浓度。

(3)目的片段的连接与转化

将胶回收纯化产物与peasy-blunt克隆载体的摩尔比以7：1的比例将纯化产物与载体在25℃下连接10min，具体参照cloningkit试剂盒(transgen，beijing)使用说明书。吸取连接产物加入50μltransl-t1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min，然后在超净工作台上将其加入500μllb培养液，37℃下200rpm振荡培养1h，5000rpm离心1min，留下100μl上清，用枪头将沉淀重新悬浮后，吸取30μl涂到含有100μgml-1amp的lb固体平板培养基上，在37℃培养箱中倒置过夜培养。第2天用灭菌的牙签挑单菌落于含有100μgml-1amp的500μllb液体培养液中，37℃下200rpm震荡培养3～4h后，跑菌液pcr检测阳性克隆，具体步骤参照2×taqmastermix(vazyme，nanjing)使用说明书，挑选扩增产物条带大小正确的菌液进行测序，测序在广州艾基生物有限公司完成，将测序返回的序列与基因组中的序列进行比对无误后，最终获得hunip6；1基因。

实施例2hunip6；1基因的亚细胞定位分析

1、载体的构建

亚细胞定位实验的载体选用pc18-gfp载体，选取hindⅲ和bamhi作为重组位点，用primerpremier5.0软件设计带有载体同源臂的引物(序列如seqidno.5～6所示)来扩增hunip6；1基因的cdna全长序列(不包含终止密码子)，参照hdcloning试剂盒(takara，japan)的使用说明书将扩增产物连接到pc18-gfp载体，将pcr重组质粒转化大肠杆菌transl-t1感受态细胞，方法同实施例1，抗生素为kan。用带有载体同源臂的引物(引物序列如seqidno.5和6所示)进行菌液pcr检测和测序，将pcr检测的阳性菌株进行测序，得到pc18-hunip6；1亚细胞定位重组质粒。引物序列如下：

seqidno.5：

gtcgacggtatcgataagcttatggatgctgaggatcccgg；

seqidno.6：

tttactcatactagtggatcctctccggaagcttggtg。

2、重组质粒转化根癌农杆菌

吸取3μl(约200ng)的重组质粒pc18-hunip6；1加入到50μl根癌农杆菌gv3101-psoup感受态中，轻弹离心管，使其混匀，置于冰上30min，液氮冷冻5min，37℃水浴5min，冰浴2min，在超净工作台中加入500μl无抗生素的yep液体培养基，于28℃、200rpm振荡培养3～4h，5000rpm离心1min，留下100μl上清，用枪头将沉淀重新悬浮后，吸取30μl涂到yep固体平板培养基(含抗生素100μgml-1kan和50μgml-1rif)上，在28℃培养箱中倒置培养2～3d，用灭菌的牙签挑单菌落于含有100μgml-1kan和50μgml-1rif的500μl的yep液体培养液中，于28℃、200rpm振荡培养过夜。菌液pcr验证同上述步骤，将验证结果正确的阳性农杆菌菌株保存备用。

3、根癌农杆菌介导的本氏烟草叶片瞬时表达

用pan95-at5g19750(用于膜定位)作为对照，按照上述2的方法转化到gv3101-psoup-p19感受态中。将菌液培养至od600＝0.6～0.8后，用maa重悬液(0.5μmmes、0.02μmas、0.5μmmgcl2，ph5.7)重悬至od600＝0.4。用本氏烟草叶片农杆菌介导的瞬时表达技术，将at5g19750融合rfp，将hunip6；1基因融合gfp，再把融合后的两者以1:1的比例混合，用1ml注射器注射入本氏烟草叶片，同时注射含有空载体pc18的农杆菌作为对照。

取农杆菌浸润处理48h的烟草叶片，用剪刀将浸润区域叶片剪成约1cm2小块，置于载玻片上水滴处并浸润，用镊子小心盖上盖玻片，注意不留有气泡。将制好的片子置于蔡司激光共聚焦显微镜(zeisslcm-800)下，设置显微镜目镜至20×，在明场下调节至清晰观察到叶片表皮细胞，操作软件，选择gfp的激发波长488nm和mcherry的激发波长610nm，分别在不同的激发光下扫描，选取大部分细胞在同一平面的区域，调节荧光场gfp、mcherry及明场增益均至最佳时进行双通道荧光成像，拍摄照片，结果如图4所示。

结果如图4所示，gfp荧光与rfp荧光进行合并后发现at5g19750-rfp和hunip6；1-gfp荧光可发生重叠，该结果说明hunip6；1定位于细胞膜上。

实施例3hunip6；1基因的功能验证

1、构建载体、重组质粒和转化根癌农杆菌

将hunip6；1基因构建到由35s驱动的表达载体ppzp6k90上，抗生素为kan，重组酶切位点为xbai，设计序列如seqidno.7～8所示的引物。再把连接好的载体质粒转入农杆菌gv3101，经pcr检测为阳性菌液后保存备用，具体操作同实施例2。引物序列如下：

seqidno.7：

cattctacaactacatctagaatggatgctgaggatcccgg；

seqidno.8：

agcttgcatgccaattctagatcatctccggaagcttggtg。

2、根癌农杆菌介导的拟南芥转化

(1)在超净工作台中，将1ml上述菌液加在200mlyep培养基(含抗生素100μgml-1kan和50μgml-1rif)中，28℃、220rpm振荡培养过夜，培养至od600＝1.0。4000rpm离心15min，收集菌体，在一个开口的大器皿用花浸润培养基[1/2ms+5％蔗糖+0.03％表面活性剂(silwetl-77)，ph5.8]稀释菌体，使其od600＝0.8左右，待用。

(2)选择处于盛花期的拟南芥健壮植株，把荚果和已经开放的花剪去，将待转化的拟南芥植株平放，让花蕾完全浸入农杆菌悬浮液中1min，再将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。将处理过的拟南芥用塑料盖盖上，暗培养24h后放于23～25℃的光照条件下使其正常生长。1周后可再浸染一次。3～4周后，待拟南芥荚果开始转黄后，将其剪下放于培养皿内干燥，当拟南芥荚果大部分转黄后，即可收取全部种子存于1.5ml的离心管中(可在管内放适当的硅胶以便干燥)。待种子完全干燥后，放于1.5ml新离心管中4℃短期保存，如需要可放于-20℃冰箱内长期保存。

(3)在超净工作台上取部分拟南芥种子(200～300粒)到一个灭菌的1.5ml离心管中，先用70％的酒精处理种子2次，每次30s；再用无水乙醇悬浮种子，然后倒到一灭菌的滤纸上；待无水乙醇挥发掉后，将种子均匀地播在种子萌发培养基(1/2ms+30gl-1蔗糖+5～6gl-1琼脂+100μgml-1kan，ph5.8)上；用parafilm将培养皿封好并置于4℃处理24h，然后放到16h光照/8h黑暗条件下培养7～10d即可移栽至营养钵中，置于培养室培养3～4周后进行下一步的鉴定。

3、转基因植株的鉴定

用新型植物基因组dna快速提取试剂盒(aidlab，china)提取上述抗性植株的基因组dna，再用2×taqmastermix(vazyme，beijing)进行pcr鉴定，具体步骤参照说明书，pcr引物为序列如seqidno.7～8所示引物。反应结束后取2μl扩增产物进行凝胶电泳，检测pcr扩增产物是否正确。扩增结果如图5所示，在915bp处有明显的条带，说明该植株为转hunip6；1基因植株。

4、转基因植株的表型观察

转hunip6；1基因的拟南芥表型鉴定结果如图6所示，可以看出，转hunip6；1基因的拟南芥植株的开花时间明显早于野生型拟南芥，通过观察并记录野生型拟南芥和不同株系转基因拟南芥在抽薹高度、花蕾数量、果荚个数、莲座叶数量和抽薹个数的情况，结果如表1所示，转hunip6；1基因的拟南芥植株的抽薹高度、花蕾数量、果荚个数、莲座叶数量和抽薹个数均高于野生型拟南芥，说明hunip6；1具有促进植物提早开花的功能。

表1.拟南芥不同株系生长状况观测结果

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种促进植物提前开花的火龙果hunip6;1基因及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>915

<212>dna

<213>hunip6;1基因

<400>1

atggatgctgaggatcccggttcaacaccctcaaccccaatgaccccaggaactcctggg60

gctcccctgtttggaggatttagcggagacagacccaccacaaccccaaagaaatccctc120

ctcggcaactgcttcacagttgaaacttggcctaatgaggaagggagcttgcctgctgtc180

acctgcactatgacaatgccacctccctctgtccctctatttaagaaggtagtggcagag240

ttcatgggcaccctgatacttatctttgctgggactgccacagcaattgtaaaccagaag300

acacagggctcggagacacttatcggatgtgcggcctccagtggccttgcagttatgata360

gtcatccttgcaacaggtcacatctctggtgcccatctcaatccatctctcaccattgct420

ttcgcagcactgaaacattttccatggacccaagtgccggcgtacattgcagcacaaatg480

ctagcatctttatgtgcagcattcttgctcaagggggttttccatcccatgatgggggga540

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ttcaacctaatgttcgttgtcacagctgttgccactgacaccagagcagttggagaacta660

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ggaatatggatatacttcacagccccaatcctgggagcactctgtggggcaggtgtctat840

actgctgtcaggctgccagaagaggatgaagacgccctcaagcagccttcagcagcacca900

agcttccggagatga915

<210>2

<211>304

<212>prt

<213>hunip6;1蛋白

<400>2

metaspalagluaspproglyserthrproserthrprometthrpro

151015

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202530

thrthrthrprolyslysserleuleuglyasncysphethrvalglu

354045

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505560

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65707580

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859095

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130135140

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145150155160

leualaserleucysalaalapheleuleulysglyvalphehispro

165170175

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180185190

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195200205

alavalalathraspthrargalavalglygluleualaglyileala

210215220

valglyalathrvalmetleuasnileleuilealaglyproalathr

225230235240

glyalasermetasnprovalargthrleuglyproalailealaval

245250255

asnasnphelysglyiletrpiletyrphethralaproileleugly

260265270

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275280285

aspgluaspalaleulysglnproseralaalaproserpheargarg

290295300

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atggatgctgaggatcccgg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcatctccggaagcttggtg20

<210>5

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtcgacggtatcgataagcttatggatgctgaggatcccgg41

<210>6

<211>38

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<213>人工序列(artificialsequence)

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tttactcatactagtggatcctctccggaagcttggtg38

<210>7

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cattctacaactacatctagaatggatgctgaggatcccgg41

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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